【摘要】：目的:肺纖維化(PF)是一種多個病因引起的發(fā)病機制不完全明確的肺系疾病�，F(xiàn)已證實,氧化應激誘導的細胞氧化/抗氧化失衡是促使肺纖維化形成及進展的關鍵,Nrf2/ARE通路是重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路。前期研究發(fā)現(xiàn)益氣類中藥對肺纖維化的氧化應激損傷有顯著的保護作用,同時導師張偉臨床診療中發(fā)現(xiàn),抗纖維化組方中配伍黃芪等益氣類中藥(加減補肺湯、防己黃芪湯、補膏等)能明顯改善肺纖維化患者的預后,臨床療效顯著。本實驗基于Nrf2信號通路探究黃芪甲苷對人胚肺成纖維細胞MRC-5的抗氧化干預作用,通過觀察該通路相關基因及下游蛋白的表達情況,從而明確其抗氧化應激的機制,為臨床治療肺纖維化提供有效的理論支持。方法:首先MRC-5細胞氧化應激模型的構(gòu)建及黃芪甲苷最佳作用濃度選擇。其次實驗分組:空白組、H2O2造模組、黃芪甲苷組、H2O2造模后給予黃芪甲苷組、黃芪甲苷干預后給予H2O2組,以6、12、24h為時間監(jiān)測點,檢測SOD、CAT、MDA、GSH表達,RT-PCR檢測各組Nrf2、keap1、NQO1、HO-1mRNA的表達并比較,選取最佳時間點免疫熒光化學法觀察Nrf2的分布,并對以上數(shù)值進行比較、分析。結(jié)果:1.當H2O2濃度600μmol/L孵育24h時,使細胞抑制率達到33.96%,該刺激濃度、作用時間以及對于細胞的損傷抑制程度符合最佳造模需求,故以600umol/L作為造模濃度進行后續(xù)試驗。2.當黃芪甲苷的藥物濃度達0.3125mg/ml時,使細胞抑制率達到11.04%,該藥物劑量下,細胞抑制率較低,對MRC-5細胞損傷小,藥物濃度相對安全,將該濃度定為該實驗的藥物最大無毒濃度。3.黃芪甲苷能明顯提高MRC-5細胞內(nèi)各抗氧化指標SOD、CAT、GSH表達量,同時能顯著降低提示機體氧化損傷的指標MDA表達水平,均有時間依賴性,統(tǒng)計學意義顯著(P0.05)。4.黃芪甲苷能明顯提高MRC-5細胞內(nèi)各抗氧化蛋白HO-1、NQO1、Nrf2表達水平,降低Keap1的表達量,具有明顯的統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.黃芪甲苷能夠明顯提高細胞核內(nèi)Nrf2表達水平,并可以促進Nrf2表達由胞質(zhì)內(nèi)向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,提高機體的抗氧化能力。結(jié)論:黃芪甲苷能夠上調(diào)MRC-5細胞Nrf2的表達,增強Nrf2的轉(zhuǎn)錄激活進而上調(diào)肺部抗氧化酶和相關解毒酶類基因的表達以發(fā)揮保護作用,猜測黃芪甲苷可能是通過干預Nrf2/ARE信號轉(zhuǎn)導通路來發(fā)揮抗纖維化作用,并且有一定的預保護作用。臨床上抗纖維化組方中配伍黃芪等益氣類中藥,可能是從抗氧化應激方面對肺纖維化起到治療效果。
【圖文】：

4 實驗結(jié)果及分析4.1 CCK-8 法檢測 H2O2 誘導的 MRC-5 細胞增殖抑制情況由圖（1）可見，不同濃度的過氧化氫對人胚肺成纖維細胞細胞均有一定損傷作用，細胞增殖的抑制程度隨 H2O2 濃度升高而增強，隨時間 6h 開始延至 24h，并且由圖可以看出抑制程度呈遞增趨勢，當 H2O2 濃度 600μmol/L 孵24h 時，使細胞抑制率達到 33.96%，該刺激濃度、作用時間以及對于細胞的損抑制程度符合最佳造模需求，故可以考慮以 600umol/L H2O2 預刺激 24 小時誘的 MRC-5 氧化損傷模型進行后續(xù)試驗。

圖 2 不同濃度黃芪甲苷對 MRC-5 細胞抑制的影響3 細胞生化檢測各組 MRC-5 人胚肺成纖維細胞中 SOD、CAT 活力和 M表達圖 3 可見，與空白組與黃芪甲苷組比較，H2O2組、黃芪甲苷+H2O2組甲苷 MDA 水平增加，SOD、CAT、GSH 水平降低；H2O2組比較，黃芪甲、H2O2黃芪甲苷組 MDA 水平降低，SOD、CAT、GSH 明顯增加，組間比較 P 均異性顯著。黃芪甲苷+H2O2 組與 H2O2+黃芪甲苷組相比，黃芪甲苷干預予 H2O2 刺激組，細胞內(nèi)的抗氧化指標明顯高于 H2O2 干預 1h 后給予，同時氧化損傷指標前者低于后者，，兩者比較 P 均<0.05,具有統(tǒng)計學出黃芪甲苷優(yōu)越的預保護作用。圖 3 各組細胞內(nèi) MDA、SOD、GSH 和 CAT 水平比較（ ±s）別MDA（nmol/mg） SOD（U/mg） GSH（nmol/mg） 白組 18.02±1.10 16.03±2.00 10.05±0.05 x
【學位授予單位】：山東中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R563

【參考文獻】

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本文編號：2701287