發(fā)布時間：2020-06-05 18:46

【摘要】： 第一部分篩選反義寡核苷酸抑制哮喘大鼠CD4~+T細(xì)胞IL-4表達(dá)的研究 目的：探討針對大鼠白細(xì)胞介素4的反義寡核苷酸能否有效干預(yù)哮喘大鼠CD4~+T淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-4，并分析不同序列的反義寡核苷酸對哮喘大鼠CD4~+T細(xì)胞IL-4表達(dá)的抑制作用是否存在差異。 方法：建立哮喘大鼠模型，密度梯度離心法分離大鼠外周血單個核細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上使用免疫磁珠分離哮喘大鼠CD4~+T淋巴細(xì)胞，采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將不同的反義寡核苷酸(AS-1：反外顯子-1；AS-2：反外顯子-2；AS-3：反翻譯終止部位)和空白對照分別轉(zhuǎn)入哮喘大鼠CD4~+T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，用ELISA和半定量RT-PCR分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-4和細(xì)胞內(nèi)IL-4mRNA的水平。 結(jié)果：不同組RT-PCR結(jié)果(IL-4／β-actin相對吸光度)：AS-1、AS-2、AS-3及空白組分別為0.2615±0.1476，0.2885±0.1411，1.1012±0.3641及1.2068±0.3836(F=22.597，P＜0.01)。ELISA檢測培養(yǎng)上清液IL-4結(jié)果：AS-1、AS-2、AS-3及空白組分別為13.800±7.233，15.329±7.358，52.643±12.075及58.286±14.100(F=34.976，P＜0.01)。經(jīng)AS-1、2干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)IL-4mRNA和細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-4的水平均較AS-3和空白組干預(yù)后IL-4的水平低(P＜0.01)。 結(jié)論：IL-4反義寡核苷酸能夠抑制哮喘大鼠CD4~+T淋巴細(xì)胞IL-4和IL-4mRNA表達(dá)；不同序列IL-4反義寡核苷酸抑制作用存在差異。 第二部分?jǐn)y帶白介素-4反義基因的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建及鑒定 目的：IL-4在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著重要的觸發(fā)和推動作用。因而，構(gòu)建攜帶大鼠反義IL-4基因并含有腺相關(guān)病毒(AAV)末端反向重復(fù)序列(ITR)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒pasIL4，為今后利用其進(jìn)行哮喘基因治療的研究奠定基礎(chǔ)。 方法：利用基因重組技術(shù)將大鼠IL-4 cDNA反向克隆到已酶切去除綠色熒光蛋白(GFP)基因的真核表達(dá)載體phMGFP中，構(gòu)建重組中間質(zhì)粒載體。通過PCR技術(shù)擴(kuò)增獲取重組中間質(zhì)粒載體上的目的片段CMV_p-asIL4-SV40_E，將此目的片段定向插入已酶切處理的psub201中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pasIL4。進(jìn)一步通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)，將pasIL4轉(zhuǎn)染哮喘大鼠CD4~+T細(xì)胞，RT-PCR法和ELISA法分別檢測細(xì)胞中IL-4 mRNA和細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-4蛋白的變化。 結(jié)果：pasIL4經(jīng)限制性酶切及部分序列測序分析證實IL-4反向插入正確。pasIL4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CD4~+T細(xì)胞IL-4 mRNA水平和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4水平較未轉(zhuǎn)染組明顯下降。 結(jié)論：pasIL4重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功，為今后利用其進(jìn)行哮喘基因治療的研究奠定基礎(chǔ)。 第三部分反義白介素4重組腺相關(guān)病毒載體對哮喘大鼠體外培養(yǎng)CD4~+T淋巴細(xì)胞的影響 目的：構(gòu)建含有反義IL-4基因的重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV-asIL4)，評估我們所采用的rAAV包裝和純化技術(shù)能否獲取高滴度、高純度rAAV用于今后的實驗，并初步觀測其對取自哮喘大鼠模型的體外培養(yǎng)CD4~+T淋巴細(xì)胞作用， 方法：磷酸鈣沉淀法將質(zhì)粒pasIL4、pXX2及pXX680共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞合成攜帶反義IL-4基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-asIL4)，采用“氯仿處理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法”純化rAAV。Southern blot法檢測合成病毒的滴度；rAAV-GFP感染293T細(xì)胞，通過倒置熒光顯微鏡計數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)評估病毒活性。rAAV-asIL4感染體外培養(yǎng)的CD4~+T淋巴細(xì)胞，RT-PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)IL-4 mRNA變化，ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中IL-4蛋白變化。 結(jié)果：Southern blot檢測rAAV-asIL4和rAAV-GFP的滴度均為2.5×10~(12)病毒顆粒／ml。10μl rAAV-GFP病毒液分別感染293T細(xì)胞后，倒置熒光顯微鏡下計算熒光細(xì)胞百分比為82.1％。體外實驗中rAAV-asIL4處理組(T_0)IL-4 mRNA和蛋白水平均較A_0和C_0組明顯降低。 結(jié)論：我們可以合成并獲取高滴度、有活性的rAAV。rAAV-asIL4能抑制體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞合成分泌IL-4，為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。 第四部分反義白介素4重組腺相關(guān)病毒載體尾靜脈給藥對哮喘大鼠的影響 目的：構(gòu)建含有反義IL-4基因的重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV-asIL4)，觀測其對哮喘大鼠模型作用，探討rAAV-asIL4對于哮喘治療的潛在作用。 方法：pasIL4、pXX2及pXX6三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法構(gòu)建rAAV-asIL4，并以southern blot檢測病毒滴度。體內(nèi)實驗，將24只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即正常大鼠組(group N)，哮喘未干預(yù)組(group A)，哮喘rAAV-asIL4處理組(group T)及哮喘rAAV-GFP處理組(group C)。哮喘A、T及C組大鼠常規(guī)制作哮喘模型；T和C組大鼠于致敏前1天(day 0)和激發(fā)當(dāng)天(day 14)2次通過尾靜脈給予0.5ml(濃度1.25×10~(12)病毒顆粒／ml)相應(yīng)病毒液rAAV-asIL4和rAAV-GFP；N和A大鼠尾靜脈給予PBS代替。大鼠于末次激發(fā)后(day 21)收集外周血標(biāo)本，左肺支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本(BALF)，右上肺、右下肺、肝組織及右腎組織標(biāo)本。RT-PCR檢測外周血單個核細(xì)胞和右上肺組織中IL-4 mRNA；ELISA檢測外周血血清中IL-4、IgE以及BALF中IL-4蛋白含量；右下肺、肝組織及右腎標(biāo)本作石蠟切片，HE染色觀測病理學(xué)改變。 結(jié)果：T組外周血血清中IL-4、IgE以及BALF中IL-4蛋白含量較A和C組明顯降低；肺組織切片組織學(xué)觀測T組病變較A和C組輕；肝腎組織切片T組未觀測到明顯病變。 結(jié)論：rAAV-asIL4對哮喘有治療作用，同時短期內(nèi)副作用小，可能具有臨床應(yīng)用前景。 第五部分反義白介素4重組腺相關(guān)病毒載體氣道給藥對哮喘大鼠的影響 目的：構(gòu)建攜帶反義IL-4基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)真核表達(dá)載體，并以此干預(yù)大鼠哮喘模型，探討其作為哮喘基因治療方案的可行性。 方法：磷酸鈣沉淀法將質(zhì)粒pasIL4、pXX2及pXX680共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞合成攜帶反義IL-4基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-asIL4)。Southern blot法檢測合成病毒的滴度。rAAV-asIL4在動物實驗開始的第1天和第14天2次通過氣道給藥干預(yù)哮喘大鼠(T組)，，實驗中同時設(shè)立大鼠正常組(N組)、哮喘組(A組)以及rAAV-GFP干預(yù)組(C組)。末次激發(fā)后處理大鼠，計數(shù)肺泡灌洗液(BALF)中有核細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)，ELISA檢測BALF中IL-4和IgE蛋白量，RT-PCR檢測肺組織IL-4 mRNA變化，取肺組織作病理學(xué)檢查。 結(jié)果：分析BALF中有核細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)結(jié)果表明：T組該2項指標(biāo)較A組和C組有降低趨勢，但這3組間并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。BALF中IL-4、IgE的ELISA檢測結(jié)果以及肺組織IL-4 mRNA RT-PCR半定量檢測結(jié)果表明：T組的上述指標(biāo)水平較A組和C組均明顯降低(P＜0.01)。T組大鼠肺組織病理學(xué)改變較A組和C組輕。 結(jié)論：攜帶反義IL-4基因的rAAV載體，通過氣道給藥的方式干預(yù)哮喘大鼠模型，具有一定的療效。rAAV-asIL4可能具有一定臨床應(yīng)用前景，同時局部給藥的方式可能具有一定價值。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳小兵,董小巖,伍志堅,屈建國,侯云德;一種快速高效分離和純化重組腺病毒伴隨病毒載體的方法[J];科學(xué)通報;2000年19期

2 高亞東,熊盛道,徐永健,張珍祥,劉先勝;一氧化氮對哮喘大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞鉀通道的作用[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2003年10期

本文編號：2698457