【摘要】： 第一部分高氧對(duì)硫氧還蛋白系統(tǒng)表達(dá)的影響 【目的】建立早產(chǎn)新生大鼠高氧暴露肺損傷動(dòng)物模型,觀察高濃度氧對(duì)早產(chǎn)鼠肺組織形態(tài)學(xué)影響以及硫氧還蛋白系統(tǒng)表達(dá)水平的變化,探討硫氧還蛋白系統(tǒng)在高氧肺損傷中的可能作用。 【方法】孕21天SD大鼠行剖腹產(chǎn)術(shù),娩出的新生鼠為早產(chǎn)鼠。早產(chǎn)SD大鼠生后d1隨機(jī)分為兩組：空氣組和高氧組。高氧組持續(xù)暴露于氧濃度85%的氧箱內(nèi),空氣組置于常壓空氣中。兩組分別于空氣或高氧暴露后1、4、7、14d,10%烏拉坦腹腔注射麻醉,提取肺組織總RNA和總蛋白,采取半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶mRNA表達(dá)水平；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)硫氧還蛋白在肺組織中的分布和表達(dá)強(qiáng)度；免疫印跡法檢測(cè)肺組織硫氧還蛋白蛋白水平的動(dòng)態(tài)變化；同時(shí)采用HE染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變,并進(jìn)行輻射狀肺泡計(jì)數(shù)。 【結(jié)果】①肺組織形態(tài)學(xué)觀察：空氣對(duì)照組呈正常肺發(fā)育狀態(tài),高氧組肺組織可見明顯肺泡炎性改變和肺發(fā)育滯后,同時(shí)伴有輻射狀肺泡計(jì)數(shù)的顯著減少(p0.05)。②與空氣對(duì)照組比較,高氧暴露誘導(dǎo)了Trx、TrxR mRNA水平的顯著上調(diào),同時(shí)Trx蛋白水平也呈現(xiàn)相應(yīng)的升高(p0.05)③免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,Trx普遍分布于肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞胞漿內(nèi),高氧暴露組Trx強(qiáng)度較對(duì)照組增強(qiáng)。 【結(jié)論】高氧暴露誘導(dǎo)肺組織廣泛的炎癥反應(yīng)及肺發(fā)育落后,同時(shí)上調(diào)肺組織Trx、TrxR表達(dá)水平。Trx系統(tǒng)表達(dá)增高可能在早產(chǎn)鼠高氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要保護(hù)作用。 第二部分硫氧還蛋白對(duì)高氧暴露胎鼠肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用 【目的】觀察補(bǔ)充外源性硫氧還蛋白對(duì)高氧誘導(dǎo)的胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷的影響,探討硫氧還蛋白可能的作用機(jī)制。 【方法】無(wú)菌分離、培養(yǎng)胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞。隨機(jī)將細(xì)胞分為單純高氧暴露組和重組人硫氧還蛋白(recombinant human thioredoxin,rhTrx)處理組,兩組同時(shí)暴露于氧濃度95%的高氧環(huán)境。兩組分別于高氧暴露0、12、24、48h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成；超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性分別由其相應(yīng)的酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定；免疫印跡蛋白檢測(cè)法測(cè)定絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇(3)激酶-蛋白激酶(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號(hào)通路活性。 【結(jié)果】與單純高氧暴露組細(xì)胞比較,①rhTrx處理顯著減輕了高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的死亡,提高了細(xì)胞活力；②rhTrx顯著降低了細(xì)胞ROS的水平；③rhTrx顯著提高了錳型超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性；④rhTrx激活了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1／2(extracellular signal regulated kinase,ERK 1/2)ERK 1/2和P13K活性,而抑制了c-Jun N末端激酶1/2(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK1/2)和P38絲裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activited protein kinase,p38)的活性. 【結(jié)論】硫氧還蛋白通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成、提高抗氧化酶活性、調(diào)控MAPKs和PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)高氧暴露胎肺泡上皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。 第三部分硫氧還蛋白在高氧暴露早產(chǎn)鼠肺損傷中作用的相關(guān)機(jī)制研究 【目的】建立早產(chǎn)新生鼠高氧暴露肺損傷動(dòng)物模型,觀察外源性Trx對(duì)高氧暴露早產(chǎn)鼠肺損傷的作用,并探討Trx的可能作用機(jī)制,為高氧肺損傷的防治尋找新的靶點(diǎn)。 【方法】孕21天SD大鼠行剖腹產(chǎn)術(shù),娩出的新生鼠為早產(chǎn)鼠。早產(chǎn)鼠生后dl隨機(jī)分為3組：①空氣對(duì)照組,簡(jiǎn)稱空氣組；②單純高氧暴露組,簡(jiǎn)稱高氧組；③Trx干預(yù)+高氧暴露組,簡(jiǎn)稱Trx干預(yù)組�？諝鈱�(duì)照組置于室溫空氣中；單純高氧暴露組和Trx干預(yù)組置于密閉氧箱中,氧濃度維持85%,由數(shù)字測(cè)氧儀連續(xù)監(jiān)測(cè)。Trx干預(yù)組每日腹腔注射rhTrx (2mg/kg),空氣組和單純高氧暴露組注射與rhTrx同體積的PBS。每日觀察早產(chǎn)鼠生長(zhǎng)狀態(tài)、定時(shí)監(jiān)測(cè)體重、記錄死亡情況。于空氣或高氧暴露后14d,取肺組織標(biāo)本分別稱量肺濕和干重并計(jì)算濕干比；石蠟切片行HE染色觀察肺組織的病理學(xué)變化并進(jìn)行輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(radical alveolar counts,RAC)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR (real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)肺組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)和Toll樣受體(Toll like receptor, TLR) 2、4 mRNA表達(dá)變化；免疫印跡蛋白檢測(cè)技術(shù)觀察MAPKs、PI3K-Akt信號(hào)通路活化情況及caspase 3蛋白水平。 【結(jié)果】①空氣對(duì)照組未出現(xiàn)早產(chǎn)鼠死亡；高氧暴露早產(chǎn)鼠死亡率較高達(dá)28.6%,存活者出現(xiàn)明顯生活能力下降和體重增長(zhǎng)遲緩；與單純高氧暴露組比較,rhTrx處理顯著提高了早產(chǎn)鼠生存率,死亡率降低到11.1%,生活能力下降和體重增長(zhǎng)遲緩情況亦明顯改善；②高氧暴露能引起早產(chǎn)鼠肺組織明顯炎癥反應(yīng)和肺發(fā)育受阻,同時(shí)伴有RAC值下降,而應(yīng)用rhTrx能顯著減輕高氧導(dǎo)致的肺損傷形態(tài)學(xué)改變；③與單純高氧組比較,rhTrx顯著減輕了高氧誘導(dǎo)的早產(chǎn)鼠肺組織水腫；④熒光定量PCR結(jié)果：與空氣對(duì)照組比較,高氧暴露顯著抑制早產(chǎn)鼠肺組織VEGF、VEGR mRNA表達(dá),而對(duì)TLR4 mRNA具有上調(diào)作用,對(duì)TLR2無(wú)顯著影響；rhTrx處理顯著提高高氧暴露后肺組織VEGF、VEGR及TLR4基因水平的表達(dá)；⑤與單純高氧暴露組比較,Trx處理組早產(chǎn)鼠肺組織細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1／2(extracellular signal regulated kinase, ERK1/2)和Akt活性顯著增高,c-JunN末端激酶1/2 (c-Jun N-terminal protein kinase, JNK1/2)、P38絲裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activited protein kinase, p38)及caspase 3勺活性明顯下降(p0.05) [結(jié)論]硫氧還蛋白在早產(chǎn)鼠高氧肺損傷中具有保護(hù)作用；通過誘導(dǎo)VEGF及其受體、TLR4基因水平高表達(dá),調(diào)控MAPKs和PI3K-Akt信號(hào)通路是其發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制。
【圖文】：

ASCII正常培養(yǎng)24h

正常培養(yǎng)AECn外形呈圓形或立方形，島狀生長(zhǎng)，細(xì)胞貼壁好，胞體飽滿;高氧暴露24h后，，細(xì)胞貼壁欠佳，顏色變暗，細(xì)胞內(nèi)可見顆粒，表現(xiàn)為生長(zhǎng)不良狀態(tài)，部分細(xì)胞死亡。見圖2一1、2一。圖2一 1AEcH正常培養(yǎng)24h!!!鑫 鑫霎 霎麟鬃 鬃霎 霎霎 霎鐫…纂纂毓毓毓翼爵 爵嗡 嗡 赫 赫赫惑妾妾聾翩翩 臀 臀臀 iii圖2一 2AECI工高氧培養(yǎng)24h 2)MTT檢測(cè)高氧對(duì)AECn細(xì)胞活力的影響與正常培養(yǎng)細(xì)胞比較，隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，高氧培養(yǎng)細(xì)胞MTT值逐漸下降，細(xì)胞活力呈時(shí)間依賴性。見圖2一3。54
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R563

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2697196