【摘要】：支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種嚴(yán)重影響人類健康的慢性呼吸道疾病。研究顯示,全球哮喘病人約3億,我國(guó)哮喘患者數(shù)量龐大,且有不斷增加的趨勢(shì)。哮喘這一基因與環(huán)境因素共同導(dǎo)致的復(fù)雜疾病,即使在今天生物-環(huán)境-心理的疾病評(píng)估模式中,其發(fā)病、發(fā)展等環(huán)節(jié)仍不清楚,故此,目前對(duì)哮喘患者的治療以癥狀控制為主。多項(xiàng)臨床研究都表明,盡管大部分診斷明確的患者在規(guī)范化治療后癥狀能夠得到有效控制,卻無(wú)法逆轉(zhuǎn)或阻止哮喘的自然病史,最終產(chǎn)生不可逆的氣道結(jié)構(gòu)性改變。可以看到,哮喘的發(fā)病機(jī)制不明,使得哮喘的預(yù)防和根治成為了不可能的任務(wù)。因此探討哮喘發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療乃至預(yù)防靶點(diǎn)仍然是呼吸專業(yè)關(guān)注的重大課題。 隨著研究的不斷拓展和深入,關(guān)于哮喘發(fā)病的假說(shuō)不斷增多,其中氣道局部環(huán)境結(jié)構(gòu)、功能受損,免疫作用異常成為研究熱點(diǎn),氣道在哮喘發(fā)病中的地位被大大提升。支氣管上皮細(xì)胞(HBE),作為氣道抵抗外來(lái)侵害的第一道防線,其物理屏障作用非常明顯,氣道上皮通透性增高是致喘物質(zhì)接觸上皮下免疫細(xì)胞的第一環(huán)。同時(shí)HBE在氣道固有免疫中也發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)也證實(shí),HBE是哮喘固有免疫與獲得性免疫聯(lián)系的橋梁,在多種觸發(fā)因素作用下,HBE釋放多種炎性介質(zhì)如近年來(lái)證實(shí)與哮喘炎癥相關(guān)的TSLP, VEGF,與免疫、炎性細(xì)胞發(fā)生廣泛的聯(lián)系,還能夠通過(guò)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化成為氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞參與氣道重建過(guò)程,可見HBE從各個(gè)環(huán)節(jié)參與了哮喘的發(fā)生、發(fā)展。 哮喘中多種細(xì)胞因子表達(dá)、釋放存在異常,這些因子參與了氣道免疫失衡的發(fā)生、發(fā)展,維持著哮喘氣道炎癥,促使氣道改建。因此,探討引發(fā)炎癥失衡的關(guān)鍵細(xì)胞因子會(huì)給哮喘的防治帶來(lái)新的曙光。有研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),能使哮喘的氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應(yīng)性等病理生理變化趨于正常化。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)VEGF在職業(yè)哮喘誘發(fā)因素甲苯二異氰酸鹽(TDI),屋塵螨以及過(guò)氧化氫等能夠?qū)е翲BE通透性增高的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。上述均提示VEGF在哮喘的發(fā)病中占有一席之地,VEGF可能成為哮喘防治的重要靶點(diǎn)。 1,25-二羥維生素D3(1,25(OH)2D3)是維生素D3的生物活性代謝產(chǎn)物,現(xiàn)在學(xué)界將其歸為激素一種,而不僅僅是維生素。它的生物學(xué)效應(yīng)是由一種核受體超家族成員-維生素D受體(Vitamin D receptor, VDR)介導(dǎo),同時(shí)還有一部分效應(yīng)是通過(guò)與胞膜的VDR結(jié)合,經(jīng)由非基因組信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。1,25-二羥維生素D3除了調(diào)節(jié)鈣和骨代謝,還發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。APC和T細(xì)胞是它在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的主要靶細(xì)胞。1,25-二羥維生素D3及其類似物可直接作用于T細(xì)胞,或通過(guò)調(diào)節(jié)APC的功能間接影響T細(xì)胞的功能。1,25-二羥維生素D3及其類似物如：25羥基維生素D3,都對(duì)APC和T細(xì)胞的作用,這種作用有賴于這兩種細(xì)胞內(nèi)VDR的表達(dá),以及它們信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的共同靶分子。已有許多實(shí)驗(yàn)證實(shí),1,25-二羥維生素D。下調(diào)T細(xì)胞和APC內(nèi)核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)的表達(dá)。眾所周知,哮喘的發(fā)生與免疫失調(diào)密切相關(guān),維生素D對(duì)APC和T細(xì)胞的作用,是否是它在哮喘中進(jìn)行調(diào)節(jié)的途徑,尚不得而知,但已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)維生素D能夠通過(guò)影響免疫細(xì)胞的活化、功能達(dá)到影響免疫相關(guān)疾病如：糖尿病,炎癥性腸病的作用,那么它對(duì)同樣由T細(xì)胞參與介導(dǎo)的哮喘又有怎樣的作用,是個(gè)引人深思的課題。 近期通過(guò)人類基因芯片的研究比對(duì),研究者們發(fā)現(xiàn)：編碼維生素D通路,包括維生素D的轉(zhuǎn)活、代謝、作用途徑的關(guān)鍵蛋白(CYP27A1,CYP27B1,CYP2R1,CYP24A1)以及一些可由維生素D調(diào)控轉(zhuǎn)錄的因子,它們的編碼基因經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析與哮喘相關(guān)(P0.05),這顯示了維生素D與哮喘發(fā)病根本、直接的聯(lián)系。 近年來(lái),環(huán)境因素和人們的生活模式在哮喘發(fā)病中的作用越來(lái)越明確。而一些人群健康問(wèn)題,例如：普遍的人群維生素D低水平狀況是否與一些疾病發(fā)生相關(guān)被研究者們關(guān)注。關(guān)于維生素D與過(guò)敏性疾病的研究層出不窮。在VDR敲除小鼠中誘發(fā)哮喘模型中發(fā)現(xiàn),雖然IgE濃度增高和Th2型細(xì)胞因子增加,但這種小鼠并沒有發(fā)生氣道炎癥、嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)或氣道高反應(yīng)性等哮喘樣癥狀。上述研究證據(jù)說(shuō)明了維生素D在哮喘發(fā)病中的地位。但維生素D調(diào)節(jié)哮喘的具體環(huán)節(jié)尚鮮見報(bào)道,本研究是在前期證明TDI促進(jìn)氣道上皮通透性部分經(jīng)由VEGF途徑的基礎(chǔ)上,通過(guò)建立維生素D作用細(xì)胞的模型,試圖觀察這一過(guò)程,了解維生素D對(duì)正常16HBE和TDI刺激的16HBE的通透性及VEGF表達(dá)的影響,在體外探討維生素D對(duì)氣道上皮炎癥介質(zhì)的釋放及屏障功能的影響及可能機(jī)制。 方法： 1、制備甲苯二異氰酸酯-人血清白蛋白復(fù)合物(TDI-HSA)。 2、購(gòu)買分析純的25羥維生素D3。 3、人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE的傳代,培養(yǎng)。 4、四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)(不同濃度)25羥維生素D3,TDI-HSA對(duì)16-HBE活力的影響。分組情況：(1)25羥維生素D3作用：對(duì)照組,2×10-9mol/L 25羥維生素D3組,4×10-9mol/L 25羥維生素D3組,6×10-9mol/L 25羥維生素D3組,8×10-9mol/L 25羥維生素D3組,10×10-9mol/L 25羥維生素D3組,12×10-9mol/L25羥維生素D3組,15×10-9mol/L 25羥維生素D3組,20×10-9mol/L25羥維生素D3組；(2)TDI-HSA刺激：對(duì)照組,20μg/mlTDI-HSA組,40μg/ml TDI-HSA組,60μg/ml TDI-HSA組,80μg/ml TDI-HSA組,100μg/ml TDI-HSA組,150μg/ml TDI-HSA組。 5、測(cè)定不同濃度25羥維生素D3和TDI-HSA對(duì)16-HBE細(xì)胞單層電阻的影響。分組情況：(1)25羥維生素D3處理：陰性對(duì)照組,5×10-9mol/L 25羥維生素D3組,8×10-9mol/L 25羥維生素D3組,10×10"9mol/L 25羥維生素D3組；(2)TDI-HSA刺激：對(duì)照組,40μg/mlTDI-HSA組,80μg/ml TDI-HSA組,100μg/ml TDI-HSA組。上述作用因素作用細(xì)胞24h后,以膜電阻測(cè)定儀測(cè)量TRANSWELL小室的細(xì)胞單層,取平均值,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化跨膜電阻。 6、分別觀察不同濃度25羥維生素D3和TDI-HSA對(duì)16-HBE VEGF基因表達(dá)的影響,分組情況：(1)25羥維生素D3：陰性對(duì)照組,5×10-9nol/L 25羥維生素D3組,8×10-9mol/L25羥維生素D3組,10×10-9mol/L 25羥維生素D3組;(2)TDI-HSA刺激：對(duì)照組,40μg/mlTDI-HSA組,80μg/ml TDI-HSA組,100μg/ml TDI-HSA組。按上述刺激24h后,收集細(xì)胞,試劑盒一步法提取總RNA,應(yīng)用Real time-PCR檢測(cè)16-HBE的VEGF基因表達(dá)情況。 7、選取對(duì)VEGF抑制最明顯的25羥維生素D3濃度5×10-9mol/L預(yù)先處理細(xì)胞,分別作用3h、6h、9h、12h、24h,吸出含有25羥維生素D3的培養(yǎng)基,換新鮮培養(yǎng)基,然后以終濃度為100μg/ml TDI-HSA刺激各組25羥維生素D3預(yù)處理細(xì)胞,24h后收集細(xì)胞,提取總RNA,應(yīng)用Real time-PCR檢測(cè)16-HBE的VEGF基因表達(dá)情況。依照步驟5,同樣測(cè)定上述各組的跨細(xì)胞電阻,求得標(biāo)準(zhǔn)化電阻值。 8、應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)上述細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達(dá)情況。 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí)總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Dunnett's T3法檢驗(yàn),以P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、不同濃度25羥維生素D3對(duì)16-HBE細(xì)胞活力影響：25羥維生素D3在12×10-9mol/L濃度以下時(shí)對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響(與對(duì)照組相比,P=0.321)。 2、不同濃度的TDI-HSA對(duì)16-HBE細(xì)胞活力影響：當(dāng)TDI-HSA濃度達(dá)到150μg/ml后,與對(duì)照組相比細(xì)胞活力顯著下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。 3、TDI-HSA刺激可導(dǎo)致單層16HBE跨膜電阻減低(n=3,P=0.007),即增高單層16HBE通透性,同時(shí)可使VEGF表達(dá)顯著升高(基因水平與對(duì)照組比較,P0.001；蛋白水平與對(duì)照組比較,P=0.002,n=5)。 4、10-8M的25羥基維生素D3直接作用于細(xì)胞,會(huì)減低跨膜電阻(與對(duì)照組比較,P=0.002),即增高細(xì)胞層通透性,同時(shí)可從mRNA水平(與對(duì)照組比較,P0.001)和蛋白水平(與對(duì)照組比較,P0.001)降低氣道上皮細(xì)胞16HBE的VEGF表達(dá)量, 5、25羥基維生素D3處理16HBE 12小時(shí),可以顯著降低TDI-HSA刺激引起的VEGF升高(與TDI-HSA刺激組比較,P0.001)。 6、25羥基維生素D3預(yù)處理細(xì)胞12h,再給以TDI-HSA刺激,TEER低于TDI直接刺激組(P=0.046),即25羥基維生素D3和TDI-HSA共刺激增高了氣道上皮通透性。 結(jié)論： 1.25羥維生素D3可以降低16HBE VEGF的表達(dá),對(duì)TDI誘導(dǎo)的16HBE VEGF的表達(dá)和釋放同樣具有抑制作用。 2.25羥維生素D3能夠增加16HBE單層通透性,也可協(xié)同促進(jìn)TDI誘導(dǎo)的16HBE通透性的增加。 3. VEGF是上皮通透性的重要調(diào)節(jié)因子,但氣道上皮通透性除受VEGF調(diào)控外,還存在其他調(diào)節(jié)途徑。
【圖文】：

圖1、正常的16一HBE細(xì)胞(光學(xué)顯微鏡x400)Figl.Thenorml6一HBEeells(oPticalmieroseoPex400)濃度對(duì)HBE活力的影響:MTT與活細(xì)胞作用產(chǎn)上述結(jié)晶，不同密度和活力的細(xì)胞使溶液呈現(xiàn)理組OD值一空白組OD值)/(對(duì)照組OD值

DMOS可溶解上述結(jié)晶，不同密度和活力的細(xì)胞使溶液呈現(xiàn)深淺不一的顏色。細(xì)胞活力:(處理組OD值一空白組OD值)/(對(duì)照組OD值一空白組OD值 )X100%表示。結(jié)果(圖2)示，40陀/ml、60林g八111、80卜g/ml、100陀/mlTDI一HsA對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，而濃度達(dá)到120林g/lnl，150卿m!的TDI一HSA刺激明顯降低細(xì)胞活力，(P<0.001)。表2一l.MTT所測(cè)不同濃度的TDI一HSA對(duì)16~HBE活力的影響 Tab1.EffeetofTDI一 HSAOnthevitalityofl6一HBEatdifferenteoneentrationsbyMTTassay.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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2 王紅玉;林小平;郝創(chuàng)利;張純青;孫寶清;鄭勁平;陳萍;盛錦云;鄔揚(yáng)源#香港大學(xué)瑪麗醫(yī)院內(nèi)科;鐘南山;;標(biāo)準(zhǔn)化屋塵螨疫苗免疫治療對(duì)變應(yīng)性支氣管哮喘的療效[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2006年10期

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本文編號(hào)：2692627