【摘要】： 慢性阻塞性肺疾病(COPD)是嚴(yán)重危害人民身體健康的常見疾病，其發(fā)病率和死亡率在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家都呈上升趨勢，對于COPD目前還沒有確實(shí)有效的治療方法，主要原因還是其發(fā)病機(jī)制不清楚。吸煙是COPD和肺癌最重要的危險(xiǎn)因素，近90％的COPD和肺癌患者為吸煙者。在吸煙致肺癌的研究上，目前的研究發(fā)現(xiàn)香煙有毒成分可與細(xì)胞的DNA結(jié)合形成DNA加合物，DNA加合物可導(dǎo)致基因的突變、缺失和錯配等，最終導(dǎo)致肺癌的發(fā)生，但DNA加合物是否與吸煙導(dǎo)致COPD發(fā)病有關(guān)以及哪種DNA加合物與吸煙導(dǎo)致COPD發(fā)病有關(guān)至今還未有研究。 近年來，越來越多的研究表明氧化應(yīng)激在COPD發(fā)病中起重要作用。香煙煙霧含有大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，其可直接攻擊生物大分子DNA，誘發(fā)DNA鏈斷裂和多種形式的堿基修飾，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷(DNA damage)。在眾多DNA氧化損傷中，以鳥嘌呤8位碳原子的氧化最常見，其氧化產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanine，8-OHdG)為DNA經(jīng)受氧化損傷的代表性產(chǎn)物，如其不能被有效修復(fù)，會導(dǎo)致DNA復(fù)制過程中G：C→T：A顛換，該顛換在腫瘤形成中發(fā)生最早，有研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織8-OHdG含量高于非肺癌組織，但8-OHdG是否與吸煙導(dǎo)致COPD的發(fā)生有關(guān)至今還未有研究。 機(jī)體存在多種DNA修復(fù)途徑以維護(hù)基因組的穩(wěn)定，8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1(human 8-oxoguanine DNA glycosylase，簡稱hOGG1)，是堿基切除修復(fù)途徑中的一個(gè)重要成分，該基因產(chǎn)物具有DNA糖苷酶活性，可以特異性切除8-OHdG，從而避免在DNA復(fù)制過程中因錯配而導(dǎo)致的G：C→T：A顛換突變，在維持基因組穩(wěn)定上具有舉足輕重的作用。有關(guān)hOGG1表達(dá)與8-OHdG的關(guān)系的研究結(jié)果不盡一致，而且有研究發(fā)現(xiàn)，hOGG1基因具有遺傳多態(tài)性，其中位于第7外顯子第1245位堿基的C／G多態(tài)，使其編碼326位絲氨酸(Ser)變?yōu)榘腚装彼?Cys)，hOGG1-326Cys蛋白修復(fù)8-OHdG的活性顯著低于hOGG1-326Ser蛋白，提示攜帶326Cys等位基因的個(gè)體有可能修復(fù)能力低下或缺陷。X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(X-ray repair cross complementinggroup 1，XRCC1)是另一個(gè)重要的DNA損傷修復(fù)基因，在短片修復(fù)通路中其與hOGG1直接發(fā)生相互作用。迄今為止，人類已經(jīng)在XRCC1中識別了60多種單核苷酸多態(tài)，其中研究主要集中在進(jìn)化保守的三個(gè)編碼區(qū)，即26304C→T、27466G→A和28152G→A，這三個(gè)SNP導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸改變分別為194位密碼子Arg→Trp、280位密碼子Arg→His和399位密碼子Arg→Gln，他們的生物學(xué)功能目前并不完全清楚。吸煙雖為COPD最重要的危險(xiǎn)因素，但并非所有吸煙者均患COPD，這說明基因易感性在COPD發(fā)病中起重要作用。DNA修復(fù)基因hOGG1及XRCC1的單核苷酸多態(tài)性是否與部分吸煙者易患COPD有關(guān)至今還未見報(bào)道。 本研究包括兩部分，第一部分探討8-OHdG是否與吸煙導(dǎo)致COPD發(fā)生有關(guān)，本部分包括兩個(gè)分題，分題一探討淋巴細(xì)胞8-OHdG含量和肺組織8-OHdG含量的相關(guān)性，分題二探討8-OHdG與吸煙所致COPD發(fā)病的關(guān)系；第二部分探討hOGG1和XRCC1基因多態(tài)性與吸煙者易患COPD的關(guān)系。 第一部分8-OHdG與吸煙導(dǎo)致COPD發(fā)生的研究 分題1淋巴細(xì)胞8-OHdG含量與肺組織8-OHdG含量的相關(guān)性研究 【目的】探討淋巴細(xì)胞8-OHdG含量和肺組織8-OHdG含量之間是否存在相關(guān)性。 【方法】采用淋巴細(xì)胞和肺手術(shù)切除肺組織，分為COPD組和非COPD組，通過高效液相色譜-電化學(xué)法檢測8例COPD患者和8例非COPD患者淋巴細(xì)胞和肺組織8-OHdG含量。 【結(jié)果】 (1) COPD組淋巴細(xì)胞8-OHdG的含量為7．25±2．29／10~5dG，非COPD組淋巴細(xì)胞8-OHdG的含量為3.34±1．94／10~5dG，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。 (2) COPD組肺組織的8-OHdG含量為8．15±2．19／10~5dG，非COPD組肺組織8-OHdG含量為3．19±1．51／10~5dG，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。 (3) COPD組淋巴細(xì)胞8-OHdG含量與肺組織的8-OHdG含量呈明顯正相關(guān)(r=0．768，P＜0．05)；非COPD組淋巴細(xì)胞8-OHdG含量與肺組織的8-OHdG含量呈明顯正相關(guān)(r=0．787，P＜0．05)。 【結(jié)論】COPD患者淋巴細(xì)胞和肺組織8-OHdG含量明顯高于非COPD患者淋巴細(xì)胞和腫組織8-OHdG含量，且淋巴細(xì)胞8-OHdG含量與肺組織8-OHdG含量存在明顯相關(guān)性，提示可以用淋巴細(xì)胞8-OHdG研究吸煙導(dǎo)致COPD發(fā)病的關(guān)系。 分題2 8-OHdG與吸煙所致COPD發(fā)病的關(guān)系 【目的】探討8-OHdG在吸煙所致COPD發(fā)病中的作用，以及活性氧水平、hOGG1mRNA及hOGG1蛋白表達(dá)水平對8-OHdG含量的影響。 【方法】收集140例健康不吸煙者、143例健康吸煙者和129例吸煙COPD者靜脈血，分離淋巴細(xì)胞，采用高效液相色譜-電化學(xué)法檢測8-OHdG含量，2'，7'-二乙酰二氯熒光素(DCFH-DA)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)檢測hOGG1 mRNA表達(dá)，Western Blot檢測hOGG1蛋白表達(dá)。 【結(jié)果】 (1)健康吸煙組和吸煙COPD組淋巴細(xì)胞8-OHdG含量明顯高于健康不吸煙組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，且吸煙COPD組淋巴細(xì)胞8-OHdG含量明顯高于健康吸煙組，差異亦有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。 (2)健康吸煙組和吸煙COPD組淋巴細(xì)胞ROS、hOGG1 mRNA及hOGG1蛋白表達(dá)均明顯高于健康不吸煙組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)；吸煙COPD組淋巴細(xì)胞ROS水平明顯高于健康吸煙組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)；吸煙COPD組淋巴細(xì)胞hOGG1 mRNA及hOGG1蛋白表達(dá)水平明顯低于健康吸煙組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。 (3)健康吸煙組及吸煙COPD組淋巴細(xì)胞8-OHdG含量與吸煙指數(shù)均呈明顯正相關(guān)(P＜0．05)；三組淋巴細(xì)胞8-OHdG含量與淋巴細(xì)胞ROS水平均呈明顯正相關(guān)(P＜0．05)，與hOGG1 mRNA表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)(P＜0．05)，與hOGG1蛋白表達(dá)水平亦呈明顯負(fù)相關(guān)(P＜0．05)。 (4)健康不吸煙組和健康吸煙組淋巴細(xì)胞8-OHdG含量與FEV_1％預(yù)計(jì)值和FEV_1／FVC均無明顯相關(guān)性(P＞0．05)；而吸煙COPD組淋巴細(xì)胞8-OHdG含量與FEV_1％預(yù)計(jì)值和FEV_1／FVC呈顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0．575、-0．448，P＜0．05)。 【結(jié)論】吸煙COPD組淋巴細(xì)胞8-OHdG含量明顯高于健康不吸煙組與健康吸煙組淋巴細(xì)胞8-OHdG含量，提示8-OHdG水平升高與吸煙導(dǎo)致COPD發(fā)病有關(guān)。 第二部分hOGG1和XRCC1基因多態(tài)性與吸煙者易患COPD的關(guān)系 【目的】探討DNA修復(fù)基因hOGG1 Ser326Cys和XRCC1 Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln基因多態(tài)性與COPD易感性的關(guān)系。 【方法】收集201例COPD患者和309例對照，用聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長度多態(tài)方法(PCR-RFLP)分析hOGG1第326密碼子和XRCC1第194、280及399密碼子基因多態(tài)性。 【結(jié)果】 (1) hOGG1 Ser326Cys基因型攜帶者和Cys326Cys基因型攜帶者與Ser326Ser基因型攜帶者相比，COPD患病風(fēng)險(xiǎn)無明顯差異；XRCC1 Gln399Gln基因型攜帶者與Arg399Arg基因型攜帶者相比COPD患病風(fēng)險(xiǎn)亦無明顯差異；但XRCC1Arg399Gln基因型攜帶者患COPD風(fēng)險(xiǎn)明顯高于Arg399Arg基因型攜帶者，其校正后相對危險(xiǎn)度為1．55(95％CI 1．05-2．29，P＜0．05)。按吸煙特征分層后，攜帶有hOGG1 Cys326Cys基因型的現(xiàn)在吸煙者患COPD的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于攜帶Ser326Ser基因型的現(xiàn)在吸煙者，校正后相對危險(xiǎn)度為5．07(95％CI 1．84-13．95，P＜0．05)；攜帶有XRCC1 Arg399Gln基因型的現(xiàn)在吸煙者患COPD的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于攜帶Arg399Arg基因型的現(xiàn)在吸煙者，校正后相對危險(xiǎn)度為2．77(95％CI1．52-5．07，P＜0．05)。按照吸煙強(qiáng)度分層后，攜帶有hOGG1 Cys326Cys基因型的輕吸煙者患COPD的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于攜帶Ser／Ser基因型的輕度吸煙者，校正后相對危險(xiǎn)度為4．02(95％CI 1．05-16．80，P＜0．05)；攜帶有XRCC1 Gln399Gln基因型的輕度吸煙者患COPD的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于攜帶Arg399Arg基因型的輕度吸煙者，校正后相對危險(xiǎn)度為4．48(95％CI 1．35-14．90，P＜0．05)；攜帶有XRCC1Arg399Gln基因型的重度吸煙者患COPD的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于攜帶Arg399Arg基因型的重度吸煙者，校正后相對危險(xiǎn)度為2．55(95％CI 1．42-4．58．P＜0．05)。 (2) XRCC1 Trp194Trp基因型攜帶者與Arg194Arg基因型攜帶者相比患COPD的風(fēng)險(xiǎn)無明顯差異，但經(jīng)吸煙特征和吸煙強(qiáng)度分層后，在戒煙者層，攜帶XRCC1Trp194Trp基因型者相較于Arg194Arg基因型者患COPD風(fēng)險(xiǎn)減低，其校正后相對危險(xiǎn)度為0．22(95％CI 0．06-0．85，P＜0．05);在輕度吸煙者層，攜帶XRCC1Arg194Trp基因型和Trp194Trp基因型者相較于Arg194Arg基因型者患COPD風(fēng)險(xiǎn)都減低，其校正后相對危險(xiǎn)度分別為0．39(95％CI 0．16-0．94，，P＜0．05)和0．24(95％CI 0．07-0．79．P＜0．05)。 (3) XRCC1 Arg280His三種基因型在COPD組的頻率與在對照組的頻率無明顯差異(P＞0．05)，按吸煙特征和吸煙強(qiáng)度分層后，在不吸煙者層、戒煙者層、現(xiàn)在吸煙者層、輕度吸煙者層和重度吸煙者層XRCC1 Arg280His三種基因型在COPD組的頻率與在對照組的頻率均無明顯差異(P＞0．05)。 【結(jié)論】hOGG1 326Cys和XRCC1 399Gln明顯升高現(xiàn)在吸煙者和輕度吸煙者患COPD的危險(xiǎn)度，XRCC1 194Trp與降低戒煙者和輕度吸煙者患COPD的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，XRCC1 280His與COPD患病風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)性。
【圖文】：

一OHdG標(biāo)準(zhǔn)品
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R563.9

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本文編號：2689037