【摘要】：過氧化氫酶(Hydrogen peroxide:hydrogen-peroxide oxidoreductase,EC1.11.1.6)是機(jī)體抗氧化體系的一種關(guān)鍵酶,可高效分解生理和病理?xiàng)l件下生命體產(chǎn)生的過氧化氫,減輕活性氧簇(Reactive oxidative species, ROS)對(duì)組織造成的氧化損傷。本研究結(jié)果表明,過氧化氫酶以及機(jī)體ROS的含量與病毒性疾病的發(fā)展過程密切相關(guān)。病毒入侵導(dǎo)致機(jī)體過氧化氫酶活力的耗竭以及ROS含量的升高,而外源性過氧化氫酶的補(bǔ)充能在一定程度上緩解病毒性疾病的進(jìn)程。 本實(shí)驗(yàn)室從人胚胎肝細(xì)胞提取總RNA,通過分子生物學(xué)手段獲取了完整的人源過氧化氫酶基因,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了一株重組酵母菌株S4。然而在進(jìn)行表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn),該菌株的穩(wěn)定性較差,傳代后重組的人源過氧化氫酶基因出現(xiàn)了丟失和沉默,對(duì)人源過氧化氫酶的大量獲取造成了限制。因此,本研究選用pPICZaA作為穿梭載體,選用GS115作為表達(dá)宿主菌,對(duì)重組人源過氧化氫酶酵母菌株進(jìn)行了重新構(gòu)建,并對(duì)其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,所獲得的重組菌株G13遺傳穩(wěn)定性更強(qiáng),表達(dá)量也得到了大幅度的提升,由原有菌株的600U/mL提高到1500U/mL。在此基礎(chǔ)上,對(duì)重組菌株G13進(jìn)行了10L發(fā)酵罐發(fā)酵,并利用Q-Sepharose陰離子交換樹脂對(duì)發(fā)酵上清進(jìn)行分離純化,獲得了純化倍數(shù)超過了十倍,達(dá)到電泳純的酶,且酶活回收率達(dá)77%,產(chǎn)物經(jīng)過western-blot驗(yàn)證確定為人源過氧化氫酶。所獲得的重組人源過氧化氫酶比活力達(dá)到26.57kU/mg,與商品化的酶活力相當(dāng)。該研究結(jié)果為人源過氧化氫酶的穩(wěn)定和高效表達(dá)以及產(chǎn)物積累提供了一條可行的途徑。 人源過氧化氫酶由于在血液循環(huán)中迅速被代謝失活,血漿半衰期極短。此外,人源過氧化氫酶對(duì)存儲(chǔ)環(huán)境變化比較敏感,容易變性或降解而失去活性。這些性質(zhì)使人源過氧化氫酶在在藥理學(xué)研究和臨床開發(fā)應(yīng)用上受到了極大的限制。本研究選用PEG-5000作為修飾劑對(duì)重組表達(dá)所獲得的人源過氧化氫酶進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾,并優(yōu)化了修飾條件。最終通過凝膠過濾對(duì)主要修飾產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)了分離。通過對(duì)修飾前后的重組人源過氧化氫酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究和比較,證明所得到的PEG修飾產(chǎn)物與未修飾的酶相比,比活力上升了20%,且在熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性上都有所提高。PEG修飾雖然使人源過氧化氫酶的親和力有所下降,但其最大反應(yīng)速度由修飾前的72.47mmol/(min-L)上升到153.84mmol/(min-L)。此外,PEG修飾使人源過氧化氫酶在ICR小鼠體內(nèi)的血漿半衰期由少于15min延長至約75min。 PEG修飾在一定程度上改善了人源過氧化氫酶的穩(wěn)定性,為人源過氧化氫酶的研究和應(yīng)用提示了一條可能的途徑。 通過鼻腔給藥方式,本研究對(duì)不同劑量的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶對(duì)流感病毒H1N1鼠肺適應(yīng)株(FM1)引起的急性肺炎的治療作用進(jìn)行了研究并推測其作用機(jī)制。結(jié)果表明,流感病毒入侵使肺部的抗氧化防御能力明顯下降,而且抑制了吞噬細(xì)胞的功能,從而在肺組織中大量復(fù)制。病毒同時(shí)激活機(jī)體的免疫反應(yīng),使細(xì)胞因子水平顯著升高,在肺部形成炎癥細(xì)胞浸潤和肺水腫,在肺表面出現(xiàn)大面積的病灶區(qū)域,使實(shí)驗(yàn)小鼠體重急速下降,最終導(dǎo)致小鼠死亡。PEG修飾的人源過氧化氫酶在不同程度緩解了上述病理癥狀,且作用效果隨著劑量的上升而增強(qiáng)。PEG修飾的人源過氧化氫酶通過鼻腔直接作用于肺部,使肺部病變區(qū)域的抗氧化狀態(tài)得到較好的改善。100,000U/kg PEG修飾的人源過氧化氫酶將病毒入侵后肺部的過氧化氫酶活力由72U/mgprot提高至209U/mgprot,對(duì)超氧陰離子的清除能力由67U/mgprot提高至161U/mgprot,而脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA的含量則由病毒組的1.6nmol/mgprot降低至1Onmol/mgprot。PEG修飾的人源過氧化氫酶主要通過直接減輕病毒引起的肺部氧化損傷而起到緩解急性肺炎的作用。 與此同時(shí),PEG修飾的人源過氧化氫酶對(duì)病毒性肺炎小鼠免疫系統(tǒng)狀態(tài)也產(chǎn)生了影響,這種作用存在兩面性。一方面,PEG修飾的過氧化氫酶可降低甚至解除流感病毒所導(dǎo)致的對(duì)小鼠脾臟和胸腺功能的抑制,增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對(duì)病毒的吞噬和清除,增強(qiáng)非特異性免疫；而另一方面,PEG修飾的人源過氧化氫酶表現(xiàn)出對(duì)Th1型類細(xì)胞因子的抑制傾向,而對(duì)Th2型細(xì)胞因子無明顯影響,借此調(diào)節(jié)組織中的Th1/Th2,使免疫應(yīng)答向體液免疫方向偏移,從而降低過度免疫引起的組織損傷。對(duì)病毒入侵后肺組織信號(hào)傳導(dǎo)通路的分析結(jié)果顯示,PEG修飾的人源過氧化氫酶表現(xiàn)出下調(diào)肺組織的TLR-2和NF-κB基因表達(dá)的趨勢。其中100,000U/kg PEG修飾的人源過氧化氫酶對(duì)TLR-2和NF-κB表達(dá)的下調(diào)效果具有顯著性。 根據(jù)以上結(jié)果,推測人源過氧化氫酶可能通過如下機(jī)途徑對(duì)流感病毒急性肺炎進(jìn)行作用：第一,外源給予人源過氧化氫酶直接消除了病毒感染所引起的病理狀態(tài)下過量的過氧化氫并同時(shí)使其他抗氧化酶能力上升,直接減輕ROS造成的氧化應(yīng)激損傷。第二,肺組織ROS含量的降低減弱了NF-κB的活化程度,使其表達(dá)下降,繼而下調(diào)與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)并使免疫從細(xì)胞免疫向體液免疫便宜,從而降低炎癥反應(yīng)造成的損傷。第三,PEG修飾的人源過氧化氫酶有效提高了吞噬細(xì)胞的吞噬功能,增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的清除能力,降低病毒含量。通過以上三條途徑,’PEG修飾的人源過氧化氫酶有效對(duì)抗流感病毒株FM1導(dǎo)致的急性肺炎,減少肺部病毒滴度,減緩急性肺炎的病理進(jìn)程,從而減少肺組織損傷,最終降低小鼠的死亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,PEG修飾的人源過氧化氫酶具備被進(jìn)一步研究開發(fā)為治療感染引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷的藥物的潛力。
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第三章PEG修飾的人源過l#化a酶對(duì)流感病毋所致小鼠急性肺炎的作用和機(jī)制研究 自由基的清除能力。人源過氧化氫酶也對(duì)此有明顯的效果，而且未修飾和PEG修飾的人源過氧化氧酶對(duì)這種能力的提升效果相近。此外，，超氧陰離子自由基清除能力的改變對(duì)PEG修飾的人源過氧化氧酶的劑量敏感性較低。1.5丙二酸含量機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，并攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物。兩二酸(MDA)便是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物中比較有代表性的一種。MDA的量�？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的水平，間接地反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。2「
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R563.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 馮美卿,蔡欽生,宋大新,鐘江,吳滿平,周s

本文編號(hào)：2686273