發(fā)布時(shí)間：2020-05-28 22:32

【摘要】：研究背景慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種臨床上常見的慢性呼吸道炎癥性疾病,其典型表現(xiàn)為持續(xù)存在的呼吸道癥狀和氣流受限,可進(jìn)一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭,其發(fā)病率和死亡率逐年上升,在全世界范圍內(nèi)疾病死亡原因中排名第四位,2012年超過300萬人死于COPD,預(yù)計(jì)到2020年將成為第三大致死性疾病。我國人口基數(shù)大,也是COPD高發(fā)病率國家之一,最新數(shù)據(jù)顯示年死亡人數(shù)占全球慢阻肺死亡人數(shù)3 1.1%。COPD通常由空氣中有害顆�；驓怏w暴露引起和/或肺泡發(fā)育異常而導(dǎo)致,慢性氣道炎癥和氣道重塑是COPD患者的主要病理學(xué)特征。因此,目前COPD防治主要從上述兩個(gè)方面作為鍥入點(diǎn),但臨床治療效果并不很理想。有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞衰老在慢性肺部疾病的發(fā)病機(jī)理中起著重要的作用,包括COPD、哮喘、肺癌以及肺纖維化等疾病。細(xì)胞衰老是所有細(xì)胞的基本屬性,表現(xiàn)為在細(xì)胞應(yīng)激的條件下出現(xiàn)細(xì)胞生長的停滯。一般來說,細(xì)胞衰老可以被看作是機(jī)體對(duì)抗癌癥發(fā)生的一種保護(hù)機(jī)制。而另有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞衰老是一些慢性疾病的病理基礎(chǔ),例如大腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如阿爾茨海默氏癥)、心血管系統(tǒng)疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化)、肌肉骨骼系統(tǒng)疾病(如骨質(zhì)疏松癥)和COPD。細(xì)胞衰老過程與機(jī)體生理功能降低和蛋白質(zhì)降解有關(guān),其過程是不可逆轉(zhuǎn)的。特別是細(xì)胞衰老通過減少造血干細(xì)胞的數(shù)量來影響再生能力,老化細(xì)胞釋放許多細(xì)胞因子以進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥反應(yīng),從而促進(jìn)COPD患者的氣道炎癥和氣道重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。我們在前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明了 CSE誘導(dǎo)的COPD模型中細(xì)胞衰老是確實(shí)存在的。因此,細(xì)胞衰老可能存在于COPD患者的氣道上皮細(xì)胞,并可能參與COPD的發(fā)生發(fā)展過程。然而,慢性阻塞性肺病的細(xì)胞衰老具體機(jī)制尚不清楚,需要進(jìn)一步研究。從細(xì)胞衰老的角度研究COPD的早期預(yù)防及治療,有效抑制COPD氣道上皮細(xì)胞衰老的發(fā)生,可能會(huì)成為COPD臨床治療的新策略。冬蟲夏草,又名蟲草,在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中已經(jīng)被廣泛使用。冬蟲夏草中有許多生物活性成分,如蟲草多糖、蟲草素、甘醇類、氨基苯酚、麥角留醇等,都已在蟲草中發(fā)現(xiàn)。從冬蟲夏草中提取的化學(xué)成分具有多種藥理活性,包括對(duì)腎臟的保護(hù)、肝臟的保護(hù)、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗凋亡等作用。在慢性阻塞性肺病患者中,人工培養(yǎng)的冬蟲夏草可以抑制呼吸道的慢性炎癥,改善肺功能,糾正氣道Th1/Th2比例失衡,具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用,可以減輕呼吸肌疲勞,并能提高運(yùn)動(dòng)耐力。然而,盡管人工冬蟲夏草的功效作用已被廣泛應(yīng)用于慢性阻塞性肺病的治療過程中,但其對(duì)慢性阻塞性肺病細(xì)胞衰老的抑制作用的研究鮮有報(bào)道。在前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)香煙提取物(CSE)可以誘導(dǎo)體外人支氣管上皮細(xì)胞衰老,而人工冬蟲夏草可以一定程度緩解由CSE引起的氣道上皮細(xì)胞衰老。在此基礎(chǔ)上,本研究將從體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)對(duì)這個(gè)問題做進(jìn)一步探討。研究目的從細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平觀察蟲草菌液對(duì)COPD氣道上皮細(xì)胞衰老的抑制作用,并探討其可能的作用機(jī)制。研究方法搜集臨床COPD患者肺組織,利用形態(tài)學(xué)方法(HE染色和免疫組織化學(xué)染色)證實(shí)COPD氣道上皮細(xì)胞衰老的存在,并通過western blotting檢測COPD患者肺組織P16、P21蛋白的表達(dá)水平;通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)利用SA-β-gal染色、BrdU染色、熒光定量PCR和western blotting確定CSE誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)合適的作用時(shí)間和濃度并成功制作16HBE煙熏模型,進(jìn)而檢測蟲草菌液對(duì)體外16HBE煙熏模型P16、P21蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響;利用脂多糖(LPS)氣管內(nèi)滴入和被動(dòng)煙熏法成功制作COPD大鼠模型,通過形態(tài)學(xué)方法驗(yàn)證COPD模型構(gòu)建成功;并通過免疫組織化學(xué)染色、熒光定量PCR和western blotting方法觀察蟲草菌液對(duì)COPD大鼠氣道上皮細(xì)胞P16、P21蛋白及mRNA表達(dá)的影響,觀察不同劑量的蟲草菌液對(duì)COPD大鼠氣道上皮細(xì)胞P16、P21蛋白及mRNA表達(dá)影響的差異性,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測BCL-2、P53、HSP90及HIF-1 α蛋白表達(dá)探討其抗細(xì)胞衰老可能的作用機(jī)制。研究結(jié)果研究發(fā)現(xiàn),在COPD患者的氣道上皮細(xì)胞中,P16和P21蛋白及mRNA的表達(dá)水平均高于對(duì)照組,這是基于免疫組織化學(xué)染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和western blotting檢測的結(jié)果。我們在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CSE可以誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞衰老,并證實(shí)CSE作用于16HBE的合適濃度為2.0%,合適作用時(shí)間為6h。蟲草菌液可以緩解由CSE引起的細(xì)胞衰老,并發(fā)現(xiàn)蟲草菌液治療組的P16、P21蛋白及mRNA的表達(dá)低于CSE誘導(dǎo)細(xì)胞組,并可以促進(jìn)16HBE細(xì)胞的增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用HE染色觀察COPD模型大鼠肺組織病理性改變,證實(shí)COPD模型構(gòu)建成功。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western blotting檢測P16和P21的mRNA及蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在COPD模型大鼠的氣道上皮細(xì)胞中也有升高;與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同劑量蟲草菌液治療組大鼠肺組織P16和P21的mRNA及蛋白表達(dá)水平與COPD模型組比較,均存在明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BCL-2蛋白在三組16HBE細(xì)胞中均有表達(dá),而在CSE組中的表達(dá)量最高,經(jīng)過蟲草菌液處理后表達(dá)減少(CSE+蟲草菌液組),二者表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P53蛋白在CSE組16HBE細(xì)胞中的表達(dá)最高,CSE+蟲草菌液組表達(dá)量次之,對(duì)照組表達(dá)量最低,三者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HSP90蛋白在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)趨勢與BCL-2和P53相同;而HIF-1α蛋白在CSE組中表達(dá)最高,而在對(duì)照組和CSE+蟲草菌液組的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)論CSE可以誘導(dǎo)COPD氣道上皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞衰老;通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)蟲草菌液對(duì)CSE誘導(dǎo)的COPD氣道上皮細(xì)胞的衰老具有抑制作用,并可能通過抗凋亡途徑P53/BCL-2/HSP90/HIF-1 α抑制COPD支氣管上皮細(xì)胞衰老的發(fā)生。
【圖文】：

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑結(jié)果逡逑１、Ｐ１６、Ｐ２１蛋白及ｍＲＮＡ在ＣＯＰＤ患者氣道上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)逡逑我們從ＣＯＰＤ患者氣道組織ＨＥ染色切片（圖１Ａ）上可以看到，氣道上皮正逡逑常結(jié)構(gòu)破壞，杯狀細(xì)胞X椛�、纤毛倒伏、基底膜札p竦炔±碭謀�。Ｐ１６及Ｐ２１免辶x弦咦櫓舊杉咴諂郎掀は赴陌思鞍誥斜澩錚ㄍ跡保攏誨義希茫希校幕頰咦櫚謀澩鎪礁哂詼哉兆�，，测犾有统计学意义（哇E保緬澹�。ｖ嶅ｓｔｅ}睿猓歟錚簦簦椋睿玨義霞?jí)潍光定量ＰＣＲ方法检诧傖果提是G校保都埃校玻鋇牡鞍�、ｍ＿b危簾澩鎪皆冢茫希校淖殄義暇哂謖Ｗ�，测犾有统计学意义（哇E保模跡保牛�。辶x希粒緬

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