發(fā)布時間：2020-05-28 17:57

【摘要】： 目的： 支氣管哮喘是一種氣道慢性炎性疾病,本質(zhì)上是一種由多種炎癥細(xì)胞、炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)共同參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥,以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞浸潤為特征。支氣管哮喘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,嚴(yán)重威脅著公眾健康,其主要病因和發(fā)病機制尚不明確,是目前研究的熱點。一般認(rèn)為在遺傳易感人群中,由正常環(huán)境變應(yīng)原引起的不適當(dāng)免疫應(yīng)答,導(dǎo)致哮喘氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展。 傳統(tǒng)認(rèn)為氣道上皮僅僅是構(gòu)成氣道內(nèi)外環(huán)境的生理屏障,通過其粘液纖毛系統(tǒng)和機械屏障作用在氣道防御中起重要作用。近年來隨著對哮喘發(fā)病機制的深入研究,發(fā)現(xiàn)氣道上皮不僅是氣道的物理屏障,而且在氣道固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)的起始、維持和調(diào)節(jié)中起著重要作用。哮喘發(fā)病過程中,內(nèi)、外源性因素(生物、物理、化學(xué)及變態(tài)反應(yīng)等)反復(fù)刺激哮喘患者氣道上皮,引起上皮損傷,釋放一系列的炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和趨化因子等,參與哮喘慢性氣道炎癥的啟動、持續(xù)和氣道重塑過程,并與哮喘的病理生理表現(xiàn)如氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)。 近年來,研究發(fā)現(xiàn)TSLP (Thymic stromal lymphopoietin,胸腺間質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素)是一種氣道上皮分泌的細(xì)胞因子,以特有方式激活DC,并誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th2分化發(fā)育,是過敏性炎癥發(fā)生的一種主要啟動因子,在過敏性疾病發(fā)生中起重要作用。大量研究證實,TSLP在哮喘患者氣道中表達增加,而且TSLP的表達量與聚集Th2的化學(xué)因子以及病情的嚴(yán)重程度相關(guān),TSLP促使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化,導(dǎo)致Th2炎癥因子釋放增加,加重氣道炎癥,在哮喘發(fā)病中有重要意義。我們試圖通過建立小鼠哮喘模型,觀察氣道上皮TSLP在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達,探討TSLP在哮喘發(fā)病中的作用及加重哮喘氣道炎癥的機制,從而更加深入明確哮喘的病因和發(fā)病機制。 方法： 雌性BALB/c小鼠30只,隨機分為生理鹽水對照組、哮喘模型組和TSLP抗體干預(yù)組,每組10只。用卵白蛋白(OVA)致敏與激發(fā)建立小鼠哮喘模型；測定小鼠的氣道反應(yīng)性；蘇木素伊紅(HE)染色觀察小鼠肺組織病理變化；收集小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF),酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測對照組和哮喘組小鼠BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的含量；實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法測定肺組織TSLPmRNA的表達；免疫組化及免疫印跡(Western blot)法測定肺組織中TSLP蛋白的表達；流式細(xì)胞術(shù)檢測BALF中樹突狀細(xì)胞(DCs)表面CD40、CD80、CD86的表達。TSLP抗體干預(yù)組,進一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測BALF中DCs表面CD40、CD80、CD86的表達, ELISA法測定BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的含量。 統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗。P0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01表示有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化圖片采用Image-prol-plus軟件分析。 結(jié)果： 1.小鼠造模成功的臨床表現(xiàn) 以小鼠出現(xiàn)明顯的煩躁不安,活動頻繁,呼吸急促,腹肌抽搐,大、小便失禁,毛發(fā)豎起,部分小鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍,動作遲緩等為誘喘成功的標(biāo)志。 2.小鼠氣道反應(yīng)性的測定 對照組與OVA組小鼠呼氣阻力基礎(chǔ)值之間無差異,注射乙酰甲膽堿(mAch)激發(fā)后,OVA組小鼠呼氣阻力較對照組明顯增高(P0.05),表明哮喘小鼠的氣道反應(yīng)性顯著高于對照組小鼠,哮喘模型制備成功。 3.HE染色觀察小鼠氣管和肺組織病理學(xué)改變 對照組小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)完整,粘膜下少量炎癥細(xì)胞浸潤；OVA組小鼠氣道上皮脫落,粘膜下大量炎性細(xì)胞浸潤和腺體增生。對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁結(jié)構(gòu)完整,氣道周圍少量炎癥細(xì)胞浸潤；OVA組支氣管上皮脫落,肺泡壁明顯增厚,血管及支氣管周圍以嗜酸性粒細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤。 4.免疫組化檢測肺組織內(nèi)TSLP的表達水平 對照組可見TSLP表達較弱,支氣管上皮僅見少量表達；OVA組可見支氣管上皮及肺泡上皮上存在大量被染成褐色TSLP陽性免疫反應(yīng),表達明顯強于對照組。 5.小鼠BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的表達水平 與對照組相比,OVA組BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的表達水平明顯增高,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 6. TSLP mRNA在肺組織的表達水平 OVA組肺組織中TSLP mRNA表達強度較對照組顯著增強,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 7.肺組織中TSLP蛋白的表達水平 OVA組肺組織中TSLP蛋白的表達水平較對照組顯著增強,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 8.BALF中DCs表面CD40、CD80、CD86分子的表達水平 與對照組相比,OVA組BALF中DCs表面CD40、CD80和CD86分子表達增強,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 9.TSLP mRNA表達強度與BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平相關(guān)性分析 OVA組TSLP mRNA的表達與BALF中IL-4、IL-5和IL-13的水平均明顯升高,直線相關(guān)Pearson分析,TSLP和IL-4呈正相關(guān)(r=0.989,p0.01),TSLP和IL-5呈正相關(guān)(r=0.996,p0.01),TSLP和IL-13呈正相關(guān)(r=0.998,p0.01) 10.TSLP抗體干預(yù)的作用 TSLP抗體干預(yù)組,肺組織中TSLPmRNA的表達較OVA組降低,但與對照組相比無差異(P0.05)；BALF中DCs表面CD40、CD80、CD86分子的表達較OVA組降低,但與對照組相比無差異(P0.05),進一步檢測BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的水平,發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-5和IL-13的表達水平較OVA組降低,但與對照組相比無差異(P0.05)。 結(jié)論： 1.TSLP在哮喘小鼠動物模型氣道上皮及肺組織內(nèi)特異性高表達。 2.TSLP通過激活DCs,誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th2分化發(fā)育啟動Th2型細(xì)胞應(yīng)答,從而加重哮喘氣道炎癥。 3.TSLP抗體干預(yù)可阻斷DCs的活化,減少Th2細(xì)胞因子的分泌,從而減輕哮喘炎癥反應(yīng)。氣道上皮可能是哮喘氣道免疫、炎癥和重塑發(fā)生根源的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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2 王文婕;王曉川;章遷;陳蓮;王瑩;徐振;;小鼠哮喘模型胸腺中胸腺基質(zhì)淋巴生成素、Foxp3的表達及調(diào)節(jié)[J];中國循證兒科雜志;2008年04期

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本文編號：2685611