【摘要】：支氣管哮喘是一種難治性的呼吸道疾病,具有病程長(zhǎng),易反復(fù)的特點(diǎn),極大的影響了患者的生活質(zhì)量。它由多種細(xì)胞包括炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)以及細(xì)胞組分參與,表現(xiàn)為氣道慢性炎癥、氣道重塑、粘液分泌增多以及氣道高反應(yīng)性。其中,T淋巴細(xì)胞是哮喘發(fā)病的重要炎癥細(xì)胞,也是必不可少的免疫細(xì)胞。根據(jù)表面抗原的不同,T淋巴細(xì)胞可以分為CD4+T和CD8+T細(xì)胞,CD4+T細(xì)胞按照產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同又可以分為輔助性T細(xì)胞(Helper T cell, Th)1和Th2細(xì)胞亞群。目前認(rèn)為哮喘的發(fā)病機(jī)制與Th1/Th2這兩個(gè)功能亞群及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子失衡相關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)了一類新的輔助性T淋巴細(xì)胞Th17,它是獨(dú)立于Th1和Th2存在的。它的發(fā)現(xiàn),打破了以往經(jīng)典的Th1/Th2模式,并為我們研究哮喘的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。已有研究表明：Th17細(xì)胞以及其相關(guān)的細(xì)胞因子參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展,然而這些研究?jī)H局限于動(dòng)物模型或哮喘患者局部氣道炎癥,對(duì)哮喘患者Th17免疫的全身性表現(xiàn)的研究尚不多見(jiàn)。然而哮喘不僅是局部而且也是全身系統(tǒng)性的免疫炎癥反應(yīng),所以過(guò)敏性哮喘患者可能也存在著異常的全身系統(tǒng)性Th17免疫。本研究旨在探討過(guò)敏性哮喘患者是否存在異常的全身性Th17免疫反應(yīng),如存在則在不同嚴(yán)重程度哮喘患者之間是否有差別,以及Th17相關(guān)細(xì)胞因子在哮喘發(fā)病中所起作用。首先,在細(xì)胞和蛋白水平,利用流式細(xì)胞術(shù)以及酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定方法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和Luminex方法檢測(cè)了過(guò)敏性哮喘組和健康對(duì)照組外周血中Th1、Th2和Th17細(xì)胞比例以及其相關(guān)因子[干擾素-γ(Interferon, IFN-γ)、白介素(Interleukin, IL)-4、IL-17、IL-22、IL-23和IL-25]的分泌水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：哮喘患者外周血中Th17細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-22和IL-23的含量均高于健康對(duì)照組,并且隨病情嚴(yán)重程度增高而增加,Th1/Th2細(xì)胞亞群和其細(xì)胞因子比例均低于健康對(duì)照組,即使一些哮喘患者接受過(guò)吸入激素的治療。我們發(fā)現(xiàn)血漿和培養(yǎng)液上清中IL-17的水平與IL-23的含量呈正相關(guān),提示IL-23可能對(duì)于Th-17的分化具有促進(jìn)作用。同時(shí),實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)分析也發(fā)現(xiàn)Th17的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒核受體(Retinoic acid-related orphan receptorγt, RORγt)在過(guò)敏性哮喘組是顯著升高的,從另一方面提示哮喘患者存在著異常的Th17免疫。另外,IL—25是IL—17家族中的成員之一,但是和IL—17在哮喘中所起的作用卻不盡相同。將過(guò)敏性哮喘組按照病情嚴(yán)重程度分級(jí)后發(fā)現(xiàn),IL—17水平在重度哮喘患者最高,并且不受吸入激素的影響；而IL—25僅在輕度哮喘患者升高,說(shuō)明這兩個(gè)細(xì)胞因子和哮喘疾病的嚴(yán)重程度之間可能存在著一定的聯(lián)系,在哮喘發(fā)病中扮演著不同的角色。為進(jìn)一步研究IL—25在哮喘發(fā)病中的作用,我們?cè)隗w外用IL—25分別刺激哮喘患者和健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood monouclear cells, PBMC),比較其分泌合成相關(guān)細(xì)胞因子的水平的差別。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL-25可以劑量依賴性地誘導(dǎo)哮喘患者PBMC合成分泌IL-4；相反,IL-25對(duì)IL-17的分泌具有抑制作用,但量效關(guān)系不明顯,綜上,Th17在哮喘疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,是對(duì)經(jīng)典的Th1/Th2模式的重要補(bǔ)充,可能為非Th2免疫為主型哮喘的發(fā)病機(jī)制以及治療提供新的理論依據(jù)。 第一部分Th17細(xì)胞在過(guò)敏性哮喘患者中的作用 目的：檢測(cè)Th17細(xì)胞亞群免疫在過(guò)敏性哮喘發(fā)病中的作用。 方法：分別采集過(guò)敏性哮喘組(n=29)和健康對(duì)照組(n=12)外周血,并分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)外周血中Th1,Th2和Th17細(xì)胞亞群的含量。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定方法(ELISA)和Luminex檢測(cè)過(guò)敏性過(guò)敏性哮喘組組和健康對(duì)照組血漿和細(xì)胞培養(yǎng)液上清中Th1細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ),Th2細(xì)胞因子白介素-4(IL-4)以及Th17免疫相關(guān)的細(xì)胞因子IL-17,IL-22,IL-23和IL-25的水平。采用實(shí)時(shí)定量PCR (RT-PCR)方法檢測(cè)Th17分化的主要轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒核受體-γ(ROR-γt)在PBMC中核酸水平的表達(dá)。 結(jié)果：1、過(guò)敏性哮喘組外周血Th1/Th2細(xì)胞亞群的含量和Th1/Th2細(xì)胞因子比例(IFN-y/IL-4)均低于健康對(duì)照組(p0.05)。2、過(guò)敏性哮喘組外周血Th2和Th17細(xì)胞亞群含量、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)液上清中相關(guān)細(xì)胞因子(IL-4、IL-17、IL-22和IL-23)的水平均高于健康對(duì)照組(p0.05),即使一些過(guò)敏性哮喘的患者接受過(guò)吸入激素治療。3、將過(guò)敏性哮喘組按照病情嚴(yán)重程度分級(jí)后發(fā)現(xiàn)：血漿中Th17細(xì)胞亞群含量以及IL-17和IL-22的水平均隨哮喘程度加重而增高,IL-25僅在輕度哮喘患者中升高。4、對(duì)Th17相關(guān)細(xì)胞因子以及其與Thl和Th2細(xì)胞因子進(jìn)行相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)：血漿中和細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-17和IL-23水平均呈正相關(guān)(r=0.526,p=0.003和r=0.428,p=0.021),而其他細(xì)胞因子之間未發(fā)現(xiàn)有明顯的相關(guān)性。5、過(guò)敏性哮喘組PBMC中ROR-γt核酸水平的表達(dá)高于健康對(duì)照組(p0.05)。 結(jié)論：以上結(jié)果表明除了Th1/Th2免疫失衡以外,異常的Th17細(xì)胞免疫以及Th17相關(guān)細(xì)胞因子可能也參與了過(guò)敏性哮喘的發(fā)病。第二部分IL-25對(duì)過(guò)敏性哮喘患者PBMc合成分泌IFN-γ、IL-4和IL-17水平的影響 目的：觀測(cè)IL-25對(duì)過(guò)敏性哮喘患者和健康人體外培養(yǎng)PBMC合成分泌IFN-γ、IL-4和IL-17水平的影響。 方法：分別采集過(guò)敏性哮喘患者組(n=29)和健康對(duì)照組(n=12)外周血,并分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。將兩組的PBMC分別分成無(wú)干預(yù)培養(yǎng)組、PMA+Ionomycin刺激組、IL-25單獨(dú)刺激組以及IL-25(50 ng/ml)+PMA+Ionomycin共刺激組分組培養(yǎng),收集各組的細(xì)胞培養(yǎng)液上清。并采用不同梯度濃度的IL-25來(lái)協(xié)同刺激PBMC。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中Thl細(xì)胞因子IFN-γ,Th2細(xì)胞因子IL-4以及Th17細(xì)胞因子IL-17的水平。 結(jié)果：1、無(wú)干預(yù)自發(fā)培養(yǎng)條件下和IL-25單獨(dú)刺激情況下,過(guò)敏性哮喘組和健康對(duì)照組培養(yǎng)液上清中IFN-γ、IL-4和IL-17的含量均不能檢測(cè)出。PMA+Ionomycin刺激后,和健康對(duì)照組相比,過(guò)敏性哮喘組PBMC分泌IL-4和IL-17的水平有所升高(P0.05),而IFN-γ的含量在兩受試組之間無(wú)顯著性差異(p0.05)。在聯(lián)合IL-25 (50 ng/ml)+PMA+Ionomycin共刺激的條件下,哮喘患者和健康人PBMC合成分泌IL-4的水平均有所升高,且哮喘患者比健康人升高幅度更明顯(P0.05)。IL-25對(duì)正常人的PBMC合成分泌IFN-γ和IL-17無(wú)明顯抑制作用(p0.05),但在哮喘患者,IL-25可以抑制IL-17的分泌(P0.05)。2、IL-25在一定濃度范圍內(nèi)(1 ng/ml—50 ng/ml)可以促進(jìn)PMA+Ionomycin刺激的過(guò)敏性哮喘患者的PBMC分泌IL-4,且具有劑量依賴關(guān)系,在50 ng/ml時(shí)達(dá)最大效應(yīng)；而IL-25對(duì)過(guò)敏性哮喘患者PBMC合成分泌IL-17抑制作用的無(wú)明顯量效關(guān)系。 結(jié)論：IL-25可以誘導(dǎo)過(guò)敏性哮喘患者PBMC合成分泌IL-4水平的增加和IL-17水平的減少,并且在一定范圍內(nèi),IL-25刺激PBMC分泌IL-4具有一定的量效關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組;支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療及教育和管理方案)[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2003年03期

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本文編號(hào)：2680280