【摘要】： 前言 肺纖維化是以大量的成纖維細胞聚集、細胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白大量沉積而導致正常的肺組織結(jié)構(gòu)改變和功能喪失的一類疾病。肺纖維化疾病包括特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)、塵肺、藥物和放射線導致的纖維化等。 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵的作用。肺損傷后肺巨噬細胞受到刺激而被激活,分泌大量潛在非活化形式的TGF-β1,稱之為潛在TGF-β1(latent-TGF-β1,L-TGF-β1),這種L-TGF-β1是由潛在聯(lián)系多肽(Latency-associated peptide,LAP)和TGF-β1以1:1的比率非共價結(jié)合而成的蛋白復合物,該蛋白復合物不能與TGF-β1受體結(jié)合,因此不能發(fā)揮其生物學活性。 血小板反應(yīng)素-1(trombospondin-1,TSP-1)是L-TGF-β1活化過程中一個重要介質(zhì)。TSP-1由3條相同肽鏈構(gòu)成的同源三聚體基質(zhì)糖蛋白,每條肽鏈由N端、C端球狀結(jié)構(gòu)域、原膠原同源區(qū)、type1重復序列、type2重復序列、type3重復序列組成。其中type1重復序列(thrombospondin type1 repeats,TSRs)由3個備解素樣基序(TSR1、TSR2、TSR3)組成。目前已清楚,TSP-1分子KRFK序列可與L-TGF-β1分子的LAP相互作用,形成TSF-1/L-TGF-β1蛋白復合物。TSR2和TSR3基序中的CSVTCG氨基酸結(jié)構(gòu)域與肺巨噬細胞膜上TSP-1受體CD36特異結(jié)合,再形成CD36/TSP-1/L-TGF-β1蛋白復合物,被激活的肺巨噬細胞同時還合成大量的纖溶酶,該蛋白復合物在纖溶酶的作用下發(fā)生空間構(gòu)象變化,使TGF-β1與LAP發(fā)生分離,從而產(chǎn)生活化的TGF-β1,繼而發(fā)揮致纖維化作用。 依據(jù)L-TGF-β1活化機制,TSP-1/L-TGF-β1蛋白復合物通過TSP-1與肺巨噬細胞膜上TSP-1受體CD36特異結(jié)合,這個過程是L-TGF-β1活化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TSP-1主要依靠TSR2-3基序中以CSVTCG氨基酸肽段為主的結(jié)構(gòu)域與CD36特異結(jié)合。據(jù)此,該研究應(yīng)用含有CSVTCG氨基酸序列的TSP-1功能片段,利用其可以與肺巨噬細胞膜上CD36特異結(jié)合的特性,從源頭上阻抑活化的TGF-β1的產(chǎn)生,從而更有效地抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。本實驗對含有CSVTCG氨基酸結(jié)構(gòu)域TSP-1分子中TSR2-3進行基因克隆、擴增及目的蛋白的表達,并在體外、體內(nèi)進一步觀察TSP-1功能片段阻抑L-TGF-β1活化及其在肺纖維化動物模型體內(nèi)抑制肺纖維化發(fā)生發(fā)展的效果,這將為闡明肺纖維化的分子機制提供實驗依據(jù)。 材料與方法 一、pGEX-5X-2-TSR2-3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 采用TRIZOL一步法提取小鼠肺組織中總mRNA,RT-PCR擴增TSR2-3基因片段。pGEX-5X-2載體和目的基因片段經(jīng)EcolRⅠ、XolⅠ雙酶切后連接構(gòu)建pGEX-5X-2-TSR2-3重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入宿主菌DH5α,菌液涂布于瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。隨機挑取單菌落,培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒DNA,雙酶切鑒定陽性菌落。 二、pGEX-5X-2-TSR2-3重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的蛋白表達、鑒定及純化 陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中,應(yīng)用濃度為1.0 mmol/L的IPTG 30℃條件下誘導培養(yǎng)3h。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析表達產(chǎn)物,考馬斯亮藍染色。免疫印跡鑒定(Western blot)鑒定表達產(chǎn)物,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)抗體反應(yīng)過夜,ECL化學發(fā)光系統(tǒng)顯色。GSTrapFF柱親和層析純化目的重組蛋白。 三、細胞免疫熒光方法檢測TSR2-3 GST融合蛋白活性及TSP-1功能片段對L-TGF-β1活化的抑制作用 大鼠肺內(nèi)注入博來霉素第7天,行氣管肺泡灌洗,收集灌洗液,獲得肺巨噬細胞。①加入TSR2-3 GST融合蛋白及GST蛋白,GST、CD36一抗反應(yīng)過夜,FITC、TRITC熒光標記的二抗定位,加核熒光染料TOP3染核。②加入TSR2-3 GST融合蛋白、GST蛋白、TSP-1功能肽段、對照肽段和CD36抗體,TGF-β1、CD36一抗反應(yīng)過夜,FITC、TRITC熒光標記的二抗定位,加核熒光染料Hoechst染核。熒光顯微鏡下觀察。 四、酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)方法檢測巨噬細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量 未經(jīng)過HCl酸化的為活化TGF-β1量,經(jīng)過HCl酸化的為總TGF-β1量。捕獲抗體包板,4℃培養(yǎng)過夜。加封閉液,室溫培養(yǎng)1h。加標準品和樣品,室溫培養(yǎng)2h,加檢測抗體室溫培養(yǎng)2h。加辣根過氧化物酶封板,避光室溫培養(yǎng)20min。加底物,避光室溫培養(yǎng)20min。加終止液,用酶標儀在450nm處測量光密度值。 五、肺組織羥脯氨酸含量測定 堿水解方法測定肺組織羥脯氨酸含量,含量以μg/mg肺組織表示。 六、肺組織學觀察 常規(guī)石蠟切片(5μm),經(jīng)脫蠟脫水后HE、vG染色,觀察肺組織病理學改變。 七、免疫組織化學方法觀察肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達 采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒(SP)對肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原進行染色。切片常規(guī)脫蠟至水,血清封閉,孵育30min;滴加稀釋的Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體,4℃過夜;PBS洗滌,滴加二抗,孵育30min;PBS洗滌,滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液,孵育30min;PBS洗滌,滴加3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)室溫顯色,蘇木素復染,中性樹脂封片。結(jié)果判斷:免疫組化結(jié)果以細胞漿或細胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色,并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對蛋白表達進行定量分析。在10×40倍視野下,在每個切片隨機選取5個視野。用陽性細胞平均積分光密度代表Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達量。 八、統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析,統(tǒng)計結(jié)果表示為(?)±s,差異有統(tǒng)計學意義時,用SNK法進行組間比較,P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。 實驗結(jié)果 一、重組pGEX-5X-2-TSR2-3質(zhì)粒的篩選與鑒定 RT-PCR擴增產(chǎn)物,瓊脂糖凝膠電泳在約390bp處出現(xiàn)特異性DNA擴增條帶,與預期理論推算一致。重組質(zhì)粒pGEX-5X-2-TSR2-3經(jīng)EcolRⅠ、XolⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳顯示酶切片段大小與預期值相符,質(zhì)粒pGEX-5X-2片段大小約為4.9kb,酶切片段大小約為360bp。測序結(jié)果與GenBank中TSP-1cDNA序列完全一致。 二、重組TSR2-3 GST融合蛋白的表達與鑒定 重組pGEX-5X-2-TSR2-3質(zhì)粒在大腸桿菌BL21表達,表達產(chǎn)物在39kDa處呈現(xiàn)清晰的蛋白帶,其分子量大小與預期結(jié)果一致。Western blot分析顯示該條帶在相應(yīng)位置處可與抗GST抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。 三、重組TSR2-3 GST融合蛋白純化 超聲破菌后,經(jīng)GSTrapFF親和柱層析后,純化產(chǎn)物在SDS-PAGE凝膠上顯示目的蛋白單一蛋白條帶。 四、TSR2-3 GST融合蛋白活性檢測結(jié)果 加入TSR2-3 GST融合蛋白博萊霉素組大鼠巨噬細胞表面,可清晰看到大量綠色(CD36)和紅色(GST)熒光顆粒重合形成黃色熒光顆粒,說明巨噬細胞表面CD36與TSR2-3 GST融合蛋白發(fā)生結(jié)合,具有功能活性。 五、TSR2-3 GST融合蛋白、TSP-1功能肽段和CD36抗體對巨噬細胞產(chǎn)生活化TGF-β1抑制作用的免疫熒光結(jié)果 加入TSR2-3 GST融合蛋白、TSP-1功能肽段和CD36抗體的巨噬細胞表面出現(xiàn)的綠色(CD36)熒光顆粒和紅色(TGF-β1)熒光顆粒重合形成黃色熒光顆粒明顯少于PBS、GST和TSP-1對照肽段組。說明TSR2-3 GST融合蛋白、TSP-1功能肽段和CD36抗體抑制巨噬細胞產(chǎn)生活化的TGF-β1,使TGF-β1減少 六、ELISA方法檢測巨噬細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量的結(jié)果 博萊霉素組和加入GST、TSP-1對照肽段組的大鼠巨噬細胞上清液中活化TGF-β1的含量及活化FGF-β1占總TGF-β1的百分比明顯高于TSR2-3 GST融合蛋白、TSP-1功能肽段和CD36抗體組。 七、小鼠肺羥脯氨酸測定結(jié)果 灌注博萊霉素后7d時,博萊霉素組、給予功能肽段低、高劑量組和給予對照肽段低、高劑量組小鼠肺羥脯氨酸含量無統(tǒng)計學差異;在灌注后14、21d時,博萊霉素組、給予對照肽段低、高劑量組小鼠肺羥脯氨酸含量顯著高于鹽水對照組(P＜0.01或P＜0.05),給予功能肽段低、高劑量組羥脯氨酸含量低于博萊霉素組(P＜0.01或P＜0.05)。 八、肺病理學檢查 博萊霉素組和給予對照肽段低劑量、高劑量組小鼠在第7d時肺組織均呈現(xiàn)明顯的肺泡炎改變。第14d肺泡炎減輕,肺泡間隔繼續(xù)增寬,肺泡間隔中成纖維細胞增多。第21d肺泡炎減輕,細胞外基質(zhì)增多,肺泡間隔明顯增寬,肺泡腔變形,肺纖維化基本形成。給予功能肽段低劑量和高劑量組第7、14d肺泡炎均較博萊霉素組輕,第21d肺纖維化亦明顯輕于博萊霉素組,各時間點膠原染色均明顯輕于博萊霉素組。 九、肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達 各時間點對照組小鼠肺組織內(nèi)有散在性分布的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白弱陽性反應(yīng)。7d時博萊霉素組和給予對照肽段組小鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達較對照組有輕度增強,積分光密度值均高于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);給予功能肽段組小鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達與對照組小鼠相似,積分光密度值無統(tǒng)計學差異。14、21d時博萊霉素組、給予對照肽段組和功能肽段組小鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達較對照組均明顯增強,3組積分光密度值均顯著高于對照組(P＜0.01或P＜0.05);給予功能肽段組在對應(yīng)時點Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達明顯輕于博萊霉素組,積分光密度值均顯著低于博萊霉素組(P＜0.01或P＜0.05)。 結(jié)論 1、成功克隆小鼠TSR2-3基因片段,并在E.coli BL21中高效表達,親和層析后獲得高純度TSR2-3 GST融合蛋白。 2、TSP-1功能片段可通過與巨噬細胞膜上的CD36特異結(jié)合阻抑內(nèi)源性TSP-1/L-TGF-β1蛋白復合物與CD36結(jié)合進而抑制了L-TGF-β1的活化。 3、CSVTCG/TSP-1功能肽段可降低由博萊霉素誘導小鼠肺纖維化模型的肺組織羥脯氨酸含量和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達,減輕肺纖維化程度,具有抑制肺纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。
【圖文】：

RT一PcR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

RT一PcR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析(2)pGEX一SX一2一TSRZ一3的酶切分析:重組質(zhì)粒pGEX一SX一2一TSRZ一3經(jīng)ECo1RI、xoll雙酶切，，2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，酶切片段大小與預期值相符(見圖2)，質(zhì)粒pGEX一SX一2片段大小約為 4.9kb，酶切片段大小約為36Obp。 4.gkb500bP250bP 5.Okb360bPMI，M2.DL2000， DL15000DNAMarker;l，2.重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切所得2個片段圖2，pGEX一SX一2一TSRZ一3經(jīng)EColRI、Xoll雙酶切分析
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R563.9

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本文編號：2679999