【摘要】： 支氣管哮喘(Asthma)是一種以肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞氣道浸潤,以黏液高分泌、氣道高反應(yīng)性、氣道重構(gòu)為特征的慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病。既往“衛(wèi)生學說”很好地解釋了近來哮喘的高發(fā)病率。減毒活菌卡介苗(Mycobacterum bovis bacillus calmette-guerin, BCG)是一種很強的Th1免疫刺激劑,動物和人體研究顯示,BCG接種和／或感染可明顯抑制哮喘的病理生理改變。我們前期研究發(fā)現(xiàn),新生鼠BCG接種可以明顯抑制成年后OVA致敏激發(fā)誘導(dǎo)的過敏性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness, AHR),這一結(jié)果令人鼓舞,為哮喘的預(yù)防提供了曙光。 一直來困擾的問題在于：BCG防治哮喘的具體機制是什么?過去的研究均以“衛(wèi)生學說”來解釋,認為BCG接種和／或感染刺激了機體Th1細胞因子的產(chǎn)生,降低了Th2細胞因子的釋放,從而達到抑制哮喘的作用.隨著新型Th細胞(Th17)以及調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的發(fā)現(xiàn)以及功能的不斷研究,這些細胞是否會在BCG防治哮喘中起作用呢?IL-17能夠促進Th1免疫,介導(dǎo)Th1細胞分泌IFN-γ,但在特定情形下也能抑制Th1免疫反應(yīng),考慮到Th17與Th1細胞之間的相互調(diào)節(jié)作用,Th17可能在BCG防治哮喘中起到一定的作用.雖然早期的研究認為微卡(Mycobacterium vaccae)能夠通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞抑制哮喘炎癥,但是其調(diào)節(jié)性T細胞并不是目前比較公認的Foxp3+ T調(diào)節(jié)細胞；最近研究發(fā)現(xiàn)BCG以及延遲冷凍抽干BCG接種能夠通過上調(diào)CD4+CD25+T細胞達到保護哮喘的作用,但是這些研究并沒有通過流式檢測CD4+CD25+Foxp3+T的百分比以及絕對數(shù)量,所以目前沒有關(guān)于BCG通過Treg細胞達到抑制哮喘作用的可信服研究.基于此,Th17和Treg細胞是否參與BCG接種防治哮喘還有待于進一步證實. 關(guān)于BCG防治哮喘比較認可的觀點仍然為：BCG促進了機體Th1免疫反應(yīng),從而達到了抑制哮喘的病理生理作用。既往的研究幾乎局限于脾臟以及BALF的Th1免疫反應(yīng),近來有研究表明BCG或者BCG衍生物接種后,局部肺組織內(nèi)增高的Th1細胞以及Th1免疫反應(yīng)在哮喘的防治中起到重要的作用。BCG接種促進了機體肺組織內(nèi)表達IFN-γ的CD4+和／或CD8+T細胞,這可能來自于CD4+和／或CD8+T細胞向肺組織的募集,或者肺內(nèi)靜息的記憶性CD4和／或CD8+T細胞在結(jié)核桿菌／OVA攻擊后引起了二次免疫。目前尚沒有“關(guān)于BCG接種后引起機體免疫系統(tǒng)(免疫功能)的變化以及這種變化在抑制哮喘的病理生理中的作用”的系統(tǒng)研究。一個非常重要但沒有闡明的問題在于：BCG接種尾根部,其引流淋巴結(jié)為腹股溝淋巴結(jié),而哮喘氣道炎癥發(fā)生的部位為肺臟,BCG接種誘發(fā)的Th1免疫應(yīng)答如何在以肺臟Th2為主導(dǎo)的過敏性氣道炎癥中起到保護作用呢?也就是說BCG皮下接種后,OVA致敏攻擊導(dǎo)致肺組織(或BALF)中增高的表達IFN-γ的CD4+T細胞的來源在哪里?BCG皮下接種后,活的細菌主要集中在引流淋巴結(jié),少量遷移到脾臟,而肺組織基本檢測不到BCG活菌的菌落數(shù),由此肺組織內(nèi)不可能產(chǎn)生效應(yīng)性T細胞。而記憶性T細胞產(chǎn)生的一個必要條件是機體抗原的清除,而BCG接種后抗原在很長時間內(nèi)不會清除,由此機體產(chǎn)生記憶性T細胞也是很困難的。由于效應(yīng)性T細胞在機體靜息狀態(tài)下可以由淋巴組織向非淋巴組織遷移,一旦機體發(fā)生炎癥反應(yīng),效應(yīng)性細胞能夠趨化募集到相應(yīng)的炎癥組織,發(fā)揮其生物學作用。為此,我們假設(shè)“BCG接種后,哮喘小鼠肺臟增高的Th1細胞和Th1免疫應(yīng)答可能來自BCG接種部位的引流淋巴結(jié)”。 由此,本研究主要分兩部分：(1)首先討論在靜息狀態(tài)以及OVA攻擊后,BCG接種對肺組織、脾臟以及引流淋巴結(jié)內(nèi)輔助T細胞(Thl, Th17)以及Treg的改變,我們發(fā)現(xiàn)只有表達IFN-γ的CD4+T細胞在OVA攻擊后向肺臟發(fā)生明顯遷移,而且這種轉(zhuǎn)移來自于BCG接種部位的引流淋巴結(jié)而不是脾臟；(2)接下來我們系統(tǒng)分析了引流淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細胞的表型以及功能變化,通過過繼試驗和體內(nèi)示蹤證實引流淋巴結(jié)內(nèi)的CD4+T細胞參與了肺組織的遷移以及抑制哮喘氣道炎癥的作用。本研究為BCG接種防治哮喘提供更有說服力的試驗依據(jù),同時為哮喘的免疫治療提供了新的方向。 第一部分：BCG早期皮下接種抑制哮喘小鼠氣道炎癥以及氣道高反應(yīng)性,該作用與表達IFN-γ的CD4+T細胞向肺組織募集相關(guān) 目的：①探討早期BCG接種對哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的保護作用；②探討B(tài)CG接種后靜息以及OVA攻擊后機體的輔助T細胞以及Treg的變化。 方法：①新生鼠接種BCG,待到6-8W后,分為三組：正常對照組(saline/saline),哮喘組(saline/OVA)和BCG處理組(BCG/OVA).以O(shè)VA致敏和激發(fā)建立哮喘模型。最后一次抗原激發(fā)后24小時檢測氣道反應(yīng)性,行支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集、肺組織病理切片觀察炎癥浸潤以及黏液分泌,檢測肺組織內(nèi)IFN-γ、Foxp3以及IL-17A的mRNA表達,ELISA行BALF中IFN-γ測定；②為了系統(tǒng)觀察BCG接種后靜息以及OVA攻擊后肺臟的輔助T細胞以及Treg變化,我們另行單獨試驗,小鼠分為四組：正常對照組(saline/saline), BCG接種靜息狀態(tài)組(BCG/saline),模型組(saline/OVA)以及BCG接種激發(fā)組(BCG/OVA)。于最后一次OVA激發(fā)48小時后,流式檢測肺臟內(nèi)表達IFN-γ以及IL-17的CD4+和CD8+T細胞,以及Foxp3+Treg細胞。同時流式檢測肺門縱隔淋巴結(jié)(MLN),脾臟(spleen)以及腹股溝淋巴結(jié)(ILN)內(nèi)表達IFN-γ的CD4+和CD8+T細胞。 結(jié)果：①saline/OVA組小鼠氣道反應(yīng)性,BALF中Eos總數(shù),肺組織炎癥浸潤以及黏液分泌均較saline/saline明顯增加(P0.05).與saline/OVA組相比,早期接種BCG顯著抑制了哮喘小鼠BALF中的Eos數(shù),減輕了AHR,抑制了肺組織的氣道炎癥以及黏液分泌(P值均0.05)。同時,BCG接種增加了肺組織中IFN-γ的mRNA表達,而不影響Foxp3和IL-17A的mRNA表達.②在靜息狀態(tài)下,BCG接種輕度增加了肺組織中表達IFN-γ的CD4+T細胞,而不改變表達IFN-γ的CD8+T細胞,表達IL-17的CD4+T細胞(Th17細胞)以及CD8+T細胞的比例,同樣,BCG接種不增加肺組織內(nèi)Foxp3+Treg細胞的比例；有趣而且令人驚奇的是,相對于靜息狀態(tài)而言,BCG接種小鼠在OVA致敏攻擊后顯著增加了肺組織內(nèi)表達IFN-γ的CD4+T細胞(p0.001).雖然也顯著增加了表達IFN-γ的CD8+T細胞(p=0.026),但是,表達IFN-γ的CD8+T細胞僅僅為表達IFN-γ的CD4+T細胞的1／6。這提示OVA致敏攻擊,導(dǎo)致大量表達IFN-γ的CD4+T細胞向BCG接種小鼠肺組織的募集。相反,Th17,表達IL-17A的CD8+T細胞以及Foxp3+ Treg細胞沒有出現(xiàn)與Thl細胞相似的變化。③靜息狀態(tài)下,BCG接種沒有改變脾臟、縱隔淋巴結(jié)內(nèi)Thl細胞和表達IFN-γ的CD8+T細胞。出乎意料的是,OVA致敏攻擊后,BCG接種顯著增加了脾臟內(nèi)表Th1細胞(p=0.001)),但不改變表達IFN-γ的CD8+T細胞；與之對應(yīng)的是,BCG接種后靜息狀態(tài)下ILN內(nèi)增高的Thl細胞在OVA致敏攻擊后明顯減少(p=0.035),而表達IFN-γ的CD8+T細胞沒有觀察到相似的變化。而在縱隔淋巴結(jié)內(nèi),單獨OVA致敏激發(fā)導(dǎo)致Thl細胞和表達IFN-γ的CD8+T細胞顯著性降低；與BCG/saline相比,Thl細胞和表達IFN-γ的CD8+T在BCG/OVA組并不增加,反而這些細胞出現(xiàn)降低(雖然統(tǒng)計學上沒有顯著性的差異)。 結(jié)論：①BCG皮下尾根部接種能夠抑制哮喘小鼠的氣道炎癥以及氣道高反應(yīng)性,這種抑制作用與迅速導(dǎo)致Th1細胞向炎癥肺組織的募集相關(guān),而與Th17,表達IL-17A的CD8+T細胞以及Foxp3+ Treg無關(guān)；③OVA致敏攻擊后,BCG接種小鼠肺內(nèi)增高的Th1細胞來自于ILN,通過脾臟向肺內(nèi)遷移,從而達到抑制哮喘氣道炎癥的作用。 第二部分：BCG接種部位的局部引流淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細胞的表型及體外功能研究 目的：進一步探討B(tài)CG接種后局部引流淋巴結(jié)(ILN)內(nèi)CD4+T細胞的表型以及功能。 方法：BCG接種方法同前。小鼠分為兩組：正常對照組(saline)和BCG接種組(BCG)。動態(tài)觀察BCG接種后ILN和脾臟的細胞數(shù)改變；由于第一部分我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BCG接種12W后ILN內(nèi)Th1細胞增高,為了進一步證實這一現(xiàn)象,繼續(xù)觀察BCG接種18W以及30W后ILN和脾臟中表達IFN-γ的CD4+T和CD8+T細胞的變化；以12W為時間點,流式檢測ILN和脾臟內(nèi)表達IL-17A的CD4+T和CD8+T細胞以及Foxp3+Treg細胞比例。以12W為時間點,定量PCR測定ILN內(nèi)IFN-γ、IL-17A以及Foxp3的mRNA水平,同時分析ILN內(nèi)淋巴細胞的細胞周期、CD4+T細胞的活化程度以及表型；以MTT法以及CFSE稀釋法檢測ILN內(nèi)淋巴細胞和CD4+T細胞的體外增殖能力,同時ELISA檢測培養(yǎng)上清內(nèi)IFN-γ的水平。 結(jié)果：①BCG接種促進了ILN細胞數(shù)呈指數(shù)級增長,但不改變脾臟的細胞數(shù)。②無論18W還是30W, BCG接種均促進了ILN內(nèi)表達IFN-γ的CD4+T細胞比例的增加(p=0.027, p=0.04, respectively).而對于脾臟細胞,BCG接種均不改變表達IFN-γ的CD4+T細胞和CD8+T細胞的百分比。同樣,BCG接種不改變ILN和脾臟內(nèi)Th17細胞和表達IL-17的CD8+T細胞,以及Foxp3+CD4+T細胞。與之相一致的是：BCG接種促進了ILN內(nèi)IFN-γ和轉(zhuǎn)錄因子T-bet的mRNA表達,而不改變IL-17A和Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的nRNA水平；③BCG接種輕度增加了ILN內(nèi)效應(yīng)和／或效應(yīng)記憶CD4+T細胞(Tef/em) (p=0.042),而對于處女型T細胞(Tnai)和中央記憶型T細胞CD4+T細胞(Tcm)沒有明顯改變；BCG接種不改變ILN細胞的增殖指數(shù),不改變ILN內(nèi)CD4+T細胞的活化程度。但是體外刺激后,BCG接種后的ILN細胞表現(xiàn)為活化程度顯的著增高,體外增殖能力的增強以及IFN-γ分泌能力的上升. 結(jié)論：①BCG接種促進了ILN而不是脾臟的增生并且導(dǎo)致ILN內(nèi)儲存大量表達IFN-γ的CD4+T細胞,而不改變表達IFN-γ的CD8+T細胞,Th17細胞,表達IL-17的CD8+T細胞,以及Foxp3+CD4+T細胞比例.②BCG接種導(dǎo)致的ILN內(nèi)的CD4+T細胞處在一種相對靜息的狀態(tài),但是一旦給予刺激,表現(xiàn)出增強的活化增殖以及分泌效應(yīng)因子能力。 第三部分：BCG接種誘導(dǎo)的局部引流淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細胞參與OVA激發(fā)后向肺組織的募集以及發(fā)揮對哮喘小鼠氣道炎癥的保護作用 目的：進一步探討B(tài)CG接種以后富集表達IFN-γ的CD4+T細胞的ILN細胞是否參與了OVA致敏激發(fā)后向肺臟組織的募集以及這些淋巴細胞是否參與了抑制哮喘氣道炎癥的作用。 方法：①本部分試驗分兩步走,早期接種BCG,這些小鼠待作過繼免疫時的“供者小鼠”(donor mice)。同時另選一批小鼠用作哮喘模型,作為細胞過繼的“受者小鼠”(recipient mice)。小鼠8W開始建立哮喘模型�！笆苷咝∈蟆痹贠VA激發(fā)前一天,接受來自于“供者小鼠”的ILN單個核細胞懸液,后誘發(fā)哮喘模型。小鼠分為3組：BCG接種ILN細胞過繼OVA攻擊組(BCG-ILN/OVA),生理鹽水對照ILN細胞過繼OVA攻擊組(saline-ILN/OVA)和過繼PBS對照OVA攻擊組(PBS/OVA)。于最后一次抗原激發(fā)后24小時檢測氣道反應(yīng)性,48小時行支氣管肺泡灌洗、肺組織病理切片觀察炎癥浸潤以及黏液分泌情況以及檢測Thl細胞因子的表達。在另一單獨試驗中,過繼脾臟細胞,分組基本同ILN細胞過繼,分為：BCG-spleen/OVA, saline-spleen/OVA以及PBS/OVA,后檢測氣道反應(yīng)性、支氣管肺泡灌洗液、肺組織病理切片觀察炎癥浸潤以及黏液分泌情況。②另外,為直接證實BCG接種后的ILN內(nèi)的淋巴細胞以及CD4+T細胞是否具有向炎癥肺組織遷移的優(yōu)先能力,我們設(shè)立三組：CFSE標記的BCG接種ILN細胞過繼OVA攻擊組(BCG-ILN/OVA), CFSE標記的saline對照ILN細胞過繼OVA攻擊組(saline-ILN/OVA)以及CFSE標記的BCG接種ILN細胞過繼saline攻擊對照組(BCG-ILN/OVA).細胞體外CFSE標記,行尾靜脈過繼,誘發(fā)哮喘模型。流式檢測CFSE陽性的淋巴細胞以及CD4+T細胞數(shù)。③分別取8W時BCG接種以及正常對照組的ILN組織,定量PCR檢測趨化因子受體CXCR3,CCR5,CXCR6, CCR6,CCR4和CCR8的mRNA水平；另外,分別檢測OVA致敏攻擊組和生理鹽水對照組的肺組織,定量PCR檢測CXCR3相匹配的趨化因子CXCL9,CXCL10和CXCL11的mRNA水平。 結(jié)果：①過繼BCG接種后的ILN細胞,表現(xiàn)為氣道反應(yīng)性的降低,BALF中Eos數(shù)的下調(diào),以及肺組織炎癥和黏液分泌的減輕,值得注意的是,這些小鼠同時伴隨著肺組織增高的IFN-γmRNA水平以及BALF中IFN-γ的表達的增加；②無論過繼BCG接種或者對照組的脾臟細胞懸液,均不能降低哮喘小鼠的病理生理改變；③與saline-ILN/OVA相比,CFSE陽性的淋巴細胞(p=0.022)以及CD4+T細胞(p=0.045)在BCG-ILN/OVA組肺組織中顯著增高。④BCG接種后ILN組織選擇性的高表達Thl細胞表面趨化因子受體CXCR3,而不增高其他T細胞相關(guān)的趨化因子受體。與之相對應(yīng)的是,OVA致敏攻擊后的肺組織高表達與CXCR3匹配的趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11。 結(jié)論：BCG接種引起的增生引流淋巴結(jié)(ILN)具有直接保護哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用,而脾臟細胞不具有這樣的保護作用,這種保護作用與ILNCD4+T細胞優(yōu)先向肺部炎癥組織遷移相關(guān)。
【圖文】：

cDS+T占CD3+T細胞的比例，所以本試驗中表達胞內(nèi)因子『N一Y和IL一 17A的百分比是針對整個CD3+T細胞而言.如圖1.3所示，在靜息狀態(tài)下，BCG接種輕度增加了肺組織中Thl細胞 (Beo/salinevss址毗/sal訪e，(2.51士0.27)0， 0vs(0.9狂0.29)%，p<0.001)，而表達正N一丫的CDS+T細胞、Thl7細胞以及表達幾一17的CDS+T細胞沒有明顯變化。同樣，，BcG接種沒有增加肺組織內(nèi)FoxP3+Treg細胞;OvA致敏攻擊后，與sallne/saline相比

而ILN為本試驗BCG皮下接種部位的局部引流淋巴結(jié)，所以，接下來我們進一步研究脾臟、縱隔淋巴結(jié)以及ILN內(nèi)表達仆N一Y的cD4+T和cDS+T細胞在的變化。如圖1.4所示，在靜息狀態(tài)下，BcG接種沒有改變脾臟、縱隔淋巴結(jié)內(nèi)表達IFN一Y的cD4+T和cDS+T細胞。但是對于ILN而言，BcG接種顯著增加了Thl細胞【 BCG/salinevsSaline/saline，(0.55士0.10)%vs(0.22士0.06)%，p二0.002]，而對表達IFN一的CDS+T沒有明顯改變 [Beo/salinevssaline/sazine，(0.22士0.08)%vs(0.33士0.11)%，p>0.05]。與saline/saline組相比
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 ;Interleukin 17-Producing γδ T Cells Increased in Patients with Active Pulmonary Tuberculosis[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年03期

2 張根生,沈華浩;早期接種減毒活菌卡介苗對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥及黏液形成的預(yù)防作用[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2005年01期

3 ;Sputum interleukin-17 is increased and associated with airway neutrophilia in patients with severe asthma[J];Chinese Medical Journal;2005年11期

本文編號：2667384