【摘要】： 第一部分機械通氣相關(guān)性肺損傷模型的建立 目的復制大鼠在體機械通氣相關(guān)性肺損傷(VILI)模型，探討機械通氣誘發(fā)肺損傷的病理生理變化和可能機制。 方法48只健康雄性SD大鼠采用3％戊巴比妥35-40mg／kg腹腔注射麻醉后行氣管切開并置入氣管導管固定，，將之隨機分為三組(n=16)：對照組(C組)：麻醉后僅做氣管切開不做機械通氣；低潮氣量機械通氣組(LV)：潮氣量(Vt)：6ml／kg，余同高潮氣量組；高潮氣量機械通氣組(HV)：Vt：42ml／kg，呼吸頻率(RR)：40次／min，吸呼比(I：E)：1：2，呼氣末正壓通氣壓力(PEEP)為0，吸入氧濃度：21％，機械通氣4h。實驗結(jié)束后分別測定各組大鼠的動脈血氣、肺組織濕／干重比(W／D)、肺通透指數(shù)(LPI)：支氣管泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量／血清蛋白比值、BALF中炎性細胞計數(shù)與分類；采用ELISA方法測定肺組織、BALF和血漿中TNF-α和MIP-2水平，并在光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察肺組織病理及超微結(jié)構(gòu)的改變。 結(jié)果(1)動脈血氣的變化實驗前三組大鼠動脈血pH值、PaCO_2和PaO_2差異無統(tǒng)計學意義，C組各時間點上述參數(shù)的變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與基礎值比較，LV組PaO_2于1h時升高，4h時PaCO_2升高(P＜0.05)；HV組1h時動脈血pH值、PaO_2升高，PaCO_2降低(P＜0.05)，4h時pH值、PaO_2降低，PaCO_2升高(P＜0.05)。(2)與C組、LV組比較，機械通氣4h時HV組大鼠LPI、W／D增加(P＜0.01)；C和LV組間二者的變化無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；與C、LV組比較，HV組BALF中總有形核細胞數(shù)增多，中性粒細胞百分比增高，肺損傷評分升高(P＜0.01)；LV組BALF中總有形核細胞數(shù)略增加，但細胞分類、肺損傷評分與C組比較，無顯著性差異(P＞0.05)。(4)與C、LV組比較，HV組于機械通氣4h時大鼠肺組織、BALF、血漿TNF-α和MIP-2水平升高(P＜0.01)，且肺組織、BALF二者的水平高于血漿中含量(P＜0.05)；LV組肺組織、BALF中TNF-α和MIP-2水平高于C組，而血漿中二者的含量與C組比較，無顯著性變化(P＞0.05)。(5)光學顯微鏡下見C組肺泡腔清晰、肺泡及其間質(zhì)無水腫、炎癥等特殊改變；LV組肺泡腔內(nèi)略有少量炎性細胞，余同C組；HV組肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔、血管旁和支氣管周圍有大量炎性細胞以巨噬細胞和淋巴細胞居多，其次中性粒細胞；肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)大量滲出物和透明膜形成，肺間質(zhì)出血和水腫。(6)電子顯微鏡下見C組肺上皮細胞結(jié)構(gòu)完整、肺泡壁和血氣屏障連續(xù)、無水腫；LV組肺泡腔內(nèi)見少量巨噬細胞，肺泡壁略增厚，余同C組；HV組肺上皮Ⅰ、Ⅱ型細胞嚴重破壞、肺泡壁水腫、基底膜破損間斷、肺泡—毛細血管屏障斷裂不連續(xù)；肺泡腔內(nèi)可見大量異形紅細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞。 結(jié)論高潮氣量機械通氣4h可復制典型的機械通氣相關(guān)性肺損傷的在體模型；由機械通氣誘發(fā)的肺損傷不但是一種機械性損傷而且合并炎性反應性損傷。 第二部分過度機械通氣對肺組織早期反應基因表達的影響 目的觀察過度機械通氣不同時點對大鼠肺組織早期生長因子(Egr-1)、C-jun和白介素-1β(IL-1β)基因和蛋白表達的變化及肺損傷程度的影響，以探討過度機械通氣誘發(fā)的肺內(nèi)早期基因表達變化和肺損傷關(guān)系。 方法選擇清潔級雄性SD大鼠40只，隨機分為對照組(A組)和機械通氣30、60、90、120min組(B、C、D、E組)，每組8只。所有動物均腹腔注射3％戊巴比妥35mg／kg麻醉后行氣管切丌置管，通氣組以Vt 42 ml／kg，RR40次／min，I：E為1：2，PEEP=0，F(xiàn)IO_2為21％，進行機械通氣；A組氣管切開置管不做機械通氣。實驗結(jié)束后放血處死大鼠，測各時間點動脈血氣，并分別以RT-PCR、免疫組化和HE染色方法測肺組織Egr-1、C-jun和IL-1β的mRNA和蛋白表達及光學顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。 結(jié)果五組大鼠PaO_2和SaO_2的變化無統(tǒng)計學意義；與A組比較，B、C組動脈血pH值升高、PaCO_2降低(P＜0.05)，D、E組各參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與B、C比較，E組動脈血pH值降低，PaCO_2升高、PaO_2、SaO_2均降低(P＜0.05)。與A組比較，B組Egr-1、C-jun、IL-1βmRNA和蛋白表達的變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；C組Egr-1、C-jun mRNA和蛋白表達增加，D、E組Egr-1、C-jun、IL-1βmRNA和蛋白表達均增加(P＜0.05)。與B、C組比較，D、E組上述三種基因、蛋白表達均增加(P＜0.05或0.01)，且E組高于D組(P＜0.05)。肺組織病理學改變光鏡下發(fā)現(xiàn)A、B組肺泡結(jié)構(gòu)未見異常，C組肺泡腔內(nèi)略有滲出、血管周圍炎癥細胞少量；D組肺泡壁略增厚、出血、肺泡腔內(nèi)滲出物和巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞、中性粒細胞等略增多，為輕度肺損傷；E組病理改變加重，為中度肺損傷。 結(jié)論過度機械通氣在肺損傷未發(fā)生時即可激活和上調(diào)肺組織中Egr-1、IL-β和C-jun的表達，且隨肺損傷的加重而表達量增加，這些基因表達的變化有可能成為肺損傷早期的表現(xiàn)或正是由于這些基因的激活而啟動VILI的開始，即可能與機械通氣誘發(fā)肺損傷的機制有關(guān)。 第三部分MAPK在機械通氣相關(guān)性肺損傷中的作用 目的觀察VILI過程中絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活性變化以及對肺損傷的影響，探討MAPK在VILI中的作用和機制。 方法72只SD大鼠隨機分為未處理的對照組(C組，不行機械通氣)、低潮氣量通氣組(LV組)、高潮氣量通氣組(HV)和采用JNK拮抗劑預處理的SP600125+C組、SP600125+LV組、SP600125+HV組；采用p38拮抗劑預處理的SB203580+C組、SB203580+LV組、SB203580+HV組及ERK拮抗劑預處理的PD98059+C組、PD98059+LV組、PD98059+HV組，共12組，每組6只大鼠。機械通氣4h后取大鼠肺組織采用Western blot方法測定各組肺組織中總JNK、ERK、p-38蛋白激酶的表達及其磷酸化水平。同時以ELISA方法測定大鼠肺組織、BALF和血漿中的腫瘤壞死因子-α(TNF—α)、巨噬細胞炎性蛋白-2(MIP-2)濃度；并測定W／D、LPI、BALF中炎性細胞數(shù)量及觀察肺組織病理變化。 結(jié)果(1)各組大鼠肺組織中總JNK、p38、ERK1／2蛋白表達無顯著差異(P＞0.05)。與C、LV組比較，HV組JNK、p38、ERK1／2的磷酸化水平顯著升高(P＜0.01)；與C組比較，LV組JNK、ERK磷酸化水平升高；與LV和HV組比較，JNK、ERK、p38特異拮抗劑預處理的LV和HV組JNK、p38、ERK1／2的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05或0.01)。(2)HV組大鼠肺組織、BALF、血漿中的TNF-α、MIP-2水平顯著高于其它組(P＜0.01)。JNK、ERK、p38拮抗劑預處理的HV組肺組織、BALF中的TNF-α、MIP-2水平較未處理HV組降低(P＜0.05或0.01)。(3)MAPK拮抗劑處理HV組，大鼠肺組織中W／D、LPI比值較未處理的HV組降低，其在BALF中的炎性細胞總數(shù)和中性粒細胞百分比也顯著減少(P＜0.05或0.01)。(4)組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)MAPK拮抗劑預處理的HV組肺水腫、肺出血及滲出較未處理HV組減輕；肺內(nèi)炎性細胞浸潤減少。 結(jié)論低、高潮氣量機械通氣均可不同程度地激活肺組織細胞中的JNK、ERK、p38激酶，且JNK、ERK、p38激酶參與了機械通氣誘發(fā)肺損傷的形成，即MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的激活可能是VILI發(fā)生機制之一。 第四部分MAPK在機械通氣過程中對NF-κB活性與表達的影響 目的觀察MAPK及其特異拮抗劑在VILI過程中對NF-κB活性和表達的影響 方法動物分組方法及其MAPK拮抗劑應用同第三部分，即將健康成年SD大鼠72只隨機分為對照組(C組)、低潮氣量通氣組(LV組)、過度通氣組(HV組)、以及三種MAPK拮抗劑SP600125、PD98059、SB203580分別處理上述三組，共12組，每組6只大鼠。機械通氣4h后，自動脈放血處死后，取肺組織以Western blot方法檢測NF-κB p65蛋白表達水平；免疫組化法測定Ⅰ-κBβ和NF-κ3在肺內(nèi)表達與分布；凝膠電泳遷移率實驗測定NF-κB的DNA結(jié)合活性。 結(jié)果(1)與C組比較，LV、HV組大鼠肺組織中的NF-κB p65增加，分別為C組的2.34、4.89倍；且HV組其含量高于LV組(P＜0.05)。而SP600125、PD98059和SB203580預處理后的C組和LV組NF-κB p65蛋白含量變化與未處理時比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；與HV組比較，SP600125+HV組、PD98058+HV組、SB203580+HV組NF-κB p65表達量分別減少49％、36％和減少25.8％(P＜0.05)。(2)EMSA測定結(jié)果：與C組比較，LV、HV組大鼠肺組織NF-κB的DNA結(jié)合活性增強分別為C組的2.31、4.76倍(P＜0.01)；與HV組比較，SP600125+HV組、PD98059+HV組、SB203580+HV組NF-κB活性分別降低55.9％、43.0％和21.6％(P＜0.05)。(3)免疫組化結(jié)果顯示：Ⅰ-κBβ和NF-κB均可在肺組織的巨噬細胞、中性粒細胞和肺、支氣管上皮細胞胞漿或胞核內(nèi)表達；Ⅰ-κBβ表達量隨潮氣量的增大而減少；而NF-κB的改變與之相反，且由細胞漿表達逐漸增加為胞核表達為主。三種MAPK拮抗劑可以抑制Ⅰ-κBβ表達的減少、抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)移并減少其在細胞漿、核內(nèi)表達量。 結(jié)論NF-κB在機械通氣過程中被激活；MAPK抑制劑可以部分抑制NF-κB核轉(zhuǎn)移，這種現(xiàn)象可能是通過抑制Ⅰ-κBβ磷酸化，減少其降解有關(guān)。機械通氣誘發(fā)肺損傷可能是通過MAPK的激活，進一步直接或間接激活NF-κB所致。 第五部分MAPK在機械通氣過程中對肺上皮細胞特異蛋白基因表達的影響 目的探討MAPK在機械通氣過程中對肺上皮細胞特異蛋白基因表達的影響。 方法將健康成年SD大鼠36只隨機分為對照組(C組)、低潮氣量通氣組(LV組)、高潮氣量通氣組(HV組)、SP600125+HV組、PD98059+HV組、SB203580+HV組，共6組，每組6只大鼠，各種拮抗劑的使用方法同第三部分。各組呼吸參數(shù)見第一部分。采用RT-PCR方法測定各組肺組織中肺Ⅰ、Ⅱ型上皮細胞特異蛋白RTI40、SP-A、B和C基因表達的變化。 結(jié)果(1)與C組比較，LV組SP-A、B、C和RTI40基因表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，HV組SP-A、SP-C表達降低，TRI40表達增加(P＜0.05或＜0.01)，SP600125+HV組、SB203580+HV組SP-A、C基因表達減少(P＜0.05)，PD98059+HV組SP-A、B和C表達變化差異不顯著(P＞0.05)。與HV組比較，SP600125+HV組、PD98059+HV組、SB203580+HV組肺組織中SP-A、C基因表達量增加(P＜0.05或＜0.01)，RTI40基因表達降低(P＜0.05)，SP-B無顯著變化。與PD98059+HV組比較，SP600125+HV組、SB203580+HV組SP-A、C基因表達量降低(P＜0.05)，三組間SP-B和TRI40基因表達變化無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 結(jié)論機械通氣可致肺上皮細胞特異蛋白SP-A、C基因表達下降和RTI40基因表達上調(diào)，而MAPK拮抗劑可部分地防止該現(xiàn)象發(fā)生；提示VILI過程中肺Ⅰ、Ⅱ上皮細胞分泌肺表面活性物質(zhì)功能受到抑制或障礙，而MAPK參與了VILI過程中肺上皮細胞分泌功能的影響。 第六部分周期牽張A549細胞致IL-8表達增加機制 目的探討周期牽張離體肺腺癌A549細胞致白介素-8(IL-8)分泌增加的機制及JNK在此過程中的作用。 方法雪將A549細胞以密度為5×10~5種植于特制的硅膠樹脂膜上，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，置于細胞牽張儀行周期性牽張。對照組：牽張強度為細胞體積擴大15％、牽張周期：30個周期／min、牽張時間分別為0、15、30、60、120 min 5個時間點。預處理組：將JNK抑制劑SP600125按照50μmol／L加入培養(yǎng)基，孵育30min后再行上述處理。收集每個時間點3次試驗后的細胞和培養(yǎng)培養(yǎng)基上清液，提取細胞中的總蛋白和RNA，采用ELISA測定細胞培養(yǎng)液中的IL-8含量；以RT—PCR方法測定細胞中IL-8mRNA的表達；Western blot測定細胞中JNK和磷酸化JNK(p-JNK)的蛋白表達和活性。 結(jié)果與細胞牽張0、15min時點比較，30min時對照組細胞IL-8基因、蛋白表達增加，且隨時間延長而增加，120min時達高峰(P＜0.05或P＜0.01)。與對照組比較，于細胞牽張30、60、120min時，預處理組IL-8基因和蛋白表達均降低(P＜0.05)；預處理組各時點細胞中IL-8的含量和基因表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。總JNK蛋白表達各組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；與0、15min時點比較，對照組p-JNK水平于30、60、120 min時點升高，且于15、30、60、120min時點，其磷酸化水平高于預處理組(P＜0.01)。 結(jié)論JNK參與了周期牽張A549細胞所致的IL-8分泌增加。JNK的激活可能為機械牽張導致肺細胞生物學損傷的機制之一。
【圖文】：

三組大鼠不同組織中與血漿中含量的比較

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