【摘要】： 第一部分香煙提取物對小鼠肺上皮細胞intelectin及白介素6、單核細胞趨化因子1表達的影響 目的：檢測香煙提取物刺激小鼠肺上皮細胞后,intelectin、IL-6和MCP-1的表達,為下一步的研究提供方向。 方法：我們選擇小鼠肺上皮細胞MLE-12作為研究細胞,首先檢測香煙提取物(CSE)對該細胞的毒性以選擇合適的刺激濃度和刺激持續(xù)時間,隨后用定量PCR方法檢測不同濃度CSE以及同一濃度不同時間點刺激小鼠肺上皮細胞后,intelectin、IL-6和MCP-1的表達。 結(jié)果：用濃度10%的CSE刺激細胞24h后,細胞活性顯著降低,而延長刺激時間至72h時,CSE濃度大于2.5%后其活性就有較明顯的下降。因此,我們選用5%CSE、10%CSE刺激小鼠肺上皮細胞24h,結(jié)果與預(yù)期的恰恰相反,定量PCR示Intelectin1 mRNA的含量隨著CSE濃度的增加逐漸增加,10%CSE組Intelectin1 mRNA的含量高于正常組,同時,IL-6 mRNA的含量在10%CSE組下降,而Intelectin2和MCP-1 mRNA的含量在三組間差異無顯著性。選用2.5%CSE分別刺激細胞8h、24h、72h后發(fā)現(xiàn),2.5%CSE刺激小鼠肺上皮細胞72h后Intelectin2 mRNA含量增加,2.5%CSE刺激24h后MCP-1 mRNA含量下降,而Intelectin1和IL-6 mRNA的表達無改變。 結(jié)論：Intelectin細胞實驗結(jié)果表明,CSE刺激小鼠肺上皮細胞后,Intelectin-1和-2表達增加,IL-6和MCP-1的表達下降,CSE對這些因子表達的不同影響可能和香煙煙霧刺激的濃度和時間的不同有關(guān),需要進一步在體內(nèi)實驗以證明其在香煙致肺部炎癥中的作用。香煙煙霧刺激后,MLE-12細胞Intelectin的升高和IL-6、MCP-1的下降存在何種關(guān)系,也需要更進一步的研究。 第二部分Intelectin在小鼠肺上皮細胞白介素6、單核細胞趨化因子1表達中的作用 目的：利用RNA干擾和基因過表達技術(shù),探討intelectin是否參與了CSE下調(diào)肺上皮細胞MLE-12中IL-6、MCP-1的表達。 方法：構(gòu)建intelectin1/2干擾質(zhì)粒PGCsi3.0-shRNA,其瞬時轉(zhuǎn)染小鼠肺上皮細胞MLE-12并用CSE刺激24h后,定量PCR檢測intelectin1、intelectin2、IL-6和MCP-1 mRNA的表達；另外采用高表達intelectin1 cDNA的質(zhì)粒pEF-BOS-ITLN1-cDNA瞬時轉(zhuǎn)染小鼠肺上皮細胞MLE-12后,48h后檢測上述基因的表達。 結(jié)果：成功構(gòu)建了intelectin1/2干擾質(zhì)粒,其能夠下調(diào)CSE刺激MLE-12細胞后的intelectin1的升高,而且,intelectin1/2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后能夠逆轉(zhuǎn)CSE引起的IL-6下降。高表達intelectin1 cDNA的質(zhì)粒pEF-BOS-ITLN1-cDNA瞬時轉(zhuǎn)染小鼠肺上皮細胞MLE-12后,48h后檢測上述基因的表達發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染該質(zhì)�？梢悦黠@升高intelectin1的表達,而IL-6 mRNA卻明顯下降。 結(jié)論：綜合RNA干擾和intelectin1 cDNA高表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肺上皮細胞MLE-12的結(jié)果,intelectin1參與了CSE下調(diào)小鼠肺上皮細胞MLE-12上IL-6 mRNA的表達。我們推論,CSE可以上調(diào)肺上皮細胞intelectin1的表達,增加的intelectin1可以降低其IL-6的表達,下降的IL-6使肺泡上皮細胞的抗感染能力下降,IL-6引起的抗感染能力下降抵消甚至超過了intelectin1本身引起的抗感染能力的增加,這可能是CSE增加肺部感染的風(fēng)險的一個原因。這些推論僅僅基于體外細胞實驗結(jié)果,intelectin到底在香煙煙霧致肺部炎癥中發(fā)揮著怎樣的作用,需要我們進一步在動物體內(nèi)進行研究。 第三部分慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)抑制煙熏小鼠肺組織Intelectin表達的研究 目的：探討intelectin在香煙煙霧致小鼠肺部炎癥中的作用。 方法：構(gòu)建小鼠intelectin1/2 RNA干擾慢病毒載體,進行病毒包裝,經(jīng)鼻滴入小鼠氣道以抑制煙熏小鼠肺組織intelectin的表達,隨后小鼠暴露于香煙煙霧4周,檢測肺泡灌洗液中細胞總數(shù)和分類細胞計數(shù)、觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變、氣道周圍炎癥改變,以及檢測肺組織中intelectin和白介素6的表達。 結(jié)果：小鼠全身暴露于香煙煙霧4周后,其肺部產(chǎn)生了亞急性炎癥,氣道周圍、肺泡炎癥細胞浸潤增加,肺組織Intelectin mRNA和蛋白水平增加,mRNA水平的增加主要體現(xiàn)在Intelectin2;肺臟的IL-6mRNA表達增加。此外,成功構(gòu)建了小鼠Intelectin1/2RNA干擾慢病毒載體并包裝成功,在氣道上皮細胞用溶血磷脂膽堿(LPC)預(yù)處理后,慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾降低了肺臟Intelectin的水平,intelectin的降低并未引起白介素6的表達改變,也并未引起明顯的肺泡灌洗液中細胞數(shù)目和種類的改變,以及氣道周圍炎癥的改變。 結(jié)論：香煙煙霧的濃度和刺激持續(xù)時間的長短將影響肺臟intelectin和白介素6的表達；用LPC預(yù)處理小鼠氣道上皮后,慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾降低了肺臟intelectin的水平,但是并未引起明顯的肺泡灌洗液中細胞數(shù)目和種類的改變,以及氣道周圍炎癥的改變, IL-6的含量也沒有受到影響,這可能是因為IL-6可以由多種細胞產(chǎn)生的結(jié)果。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R563.1

【共引文獻】

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