【摘要】：目的：研究蛋白激酶C的亞型PKCδ在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RPMVEC)中的表達(dá)，通過(guò)觀察脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RPMVEC損傷時(shí)PKCδ表達(dá)的變化，以及PKCδ抑制劑楸毒素(Rottlerin)對(duì)單層通透性增高的干預(yù)作用。探討PKC特異性亞型在LPS誘導(dǎo)的RPMVEC損傷中的作用。 方法：在體外分離、培養(yǎng)的RPMVEC的基礎(chǔ)上進(jìn)行PKCδ的Western印跡和免疫組化檢測(cè)，以及LPS作用后PKCδ表達(dá)的變化。用針頭式濾器檢測(cè)LPS及LPS+Rottlerin干預(yù)后RPMVEC單層濾過(guò)系數(shù)(Kf)的變化。 結(jié)果1 體外成功分離培養(yǎng)RPMVEC，經(jīng)形態(tài)學(xué)、Ⅷ因子相關(guān)抗原及FITC-BSI結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)所獲得為RPMVEC；在細(xì)胞傳代時(shí)采用含有EDTA的胰蛋白酶，縮短了消化傳代的時(shí)間，減少了傳代過(guò)程中胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的損傷；成功進(jìn)行了細(xì)胞的冷凍和復(fù)蘇，為今后的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。2 首先通過(guò)采用免疫組化的方法明確了PKCδ在RPMVEC中有廣泛的表達(dá)，其表達(dá)部位位于胞漿。Western印跡檢測(cè)PKCδ出現(xiàn)一條蛋白印跡條帶，分子質(zhì)量與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Mark相比，約為77KD，進(jìn)一步證實(shí)了PKCδ在RPMVEC中存在。采用10μg／ml LPS作用RPMVEC 60min后與正常對(duì)照組比較，，PKCδ表達(dá)明顯增高。3 10μg／mlLPS、5μM／L Rottlerin分別作用15、30、60、90、120min，LPS組RPMVEC單層的Kf值較對(duì)照組顯著增高，Rottlerin組較對(duì)照組無(wú)明顯差異。Rottlerin+LPS組各時(shí)相點(diǎn)Kf值顯著低于LPS組。 結(jié)論：1 成功進(jìn)行原代培養(yǎng)RPMVEC，形態(tài)學(xué)、Ⅷ因子相關(guān)抗原及FITC-BSI結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)所獲得為RPMVEC、并在對(duì)傳代方法改進(jìn)后成功對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷凍和復(fù)蘇。2 采用免疫組化的方法證實(shí)了PKCδ在RPMVEC中有表達(dá)，其表達(dá)部位在細(xì)胞漿；LPS可導(dǎo)致RPMVEC表達(dá)PKCδ增高。3 采用PKCδ特異性抑制劑Rottlerin可部分抑制LPS導(dǎo)致的RPMVEC單層通透性增高，LPS導(dǎo)致RPMVEC單層通透性增高的機(jī)制可能為激活了細(xì)胞內(nèi)的PKC途徑。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2661301