【摘要】：研究背景 支氣管哮喘(Bronchial asthma, asthma)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞成分參與的氣道慢性炎癥疾患.這種慢性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性,通常出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限。如果哮喘持續(xù)發(fā)展,氣流受限可變?yōu)椴糠挚赡�。目前認(rèn)為,這與氣道重塑的發(fā)生有關(guān)。氣道壁重塑伴有氣道上皮增生、上皮下纖維肌化、氣道平滑肌增生、微血管發(fā)生和腺體的肥大等結(jié)構(gòu)改變。各種炎癥介質(zhì)及炎癥細(xì)胞對氣管反復(fù)損傷和機(jī)體對損傷性刺激的修復(fù)性反應(yīng)引起的氣管發(fā)生改變,組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)。眾所周知,氣道平滑肌細(xì)胞(Human airway smooth muscle cell, HASMC)在哮喘氣道重塑中發(fā)揮著重要的作用,被認(rèn)為是哮喘氣道重塑的關(guān)鍵細(xì)胞。當(dāng)前的哮喘治療藥物,主要作用于慢性氣道炎癥,而氣道重塑未給予足夠重視。目前,抑制和減緩氣道重塑成為一個(gè)新的研究方向,因此越來越多學(xué)者將HASMC作為抑制和減緩氣道重塑的新靶點(diǎn)。 第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome ten, PTEN)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因,定位于10q23.3,由9個(gè)外顯子組成,編碼由403個(gè)氨基酸組成的蛋白。研究表明,PTEN在等子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、大腸癌等多種腫瘤發(fā)生中起重要作用。近年來隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)PTEN對非腫瘤疾病如：心肌肥大,高血壓動(dòng)脈粥樣硬化,支氣管哮喘哮等疾病中也發(fā)揮重要的作用。PTEN可以通過阻斷磷脂酞肌醇-3-激酶信號傳導(dǎo)通路(PI3K/PKB/AKT信號通路)及絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號傳導(dǎo)通路(Ras-Raf-MEKI/2-ERKI/2信號通路)等抑制腫瘤細(xì)胞、心肌和血管內(nèi)皮等細(xì)胞的增殖、遷移,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。 在致死性及非致死性哮喘中可見明顯平滑肌細(xì)胞增生、肥大和平滑肌向氣道上皮、內(nèi)膜的遷移發(fā)生,這在氣道重塑中起了重要的作用,使氣道壁增厚,導(dǎo)致基礎(chǔ)氣道阻力增加和不可逆性氣流阻塞的發(fā)生。這些都間接證明HASMC具有遷移的功能。雖然目前還缺乏HASMC向氣道內(nèi)膜直接遷移的證據(jù),但有研究發(fā)現(xiàn),在哮喘患者氣道活檢組織標(biāo)本中,氣道固有層內(nèi)發(fā)現(xiàn)的肌纖維母細(xì)胞在顯微結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)和位置方面都與HASMC極其相似,提示肌纖維母細(xì)胞可能是HASMC遷移并轉(zhuǎn)化而來。這種遷移與動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)的遷移相類似。而且有文獻(xiàn)表明,PTEN的過表達(dá)能抑制基礎(chǔ)和PDGF誘導(dǎo)的VSMC的增殖,遷移和存活。因此我們推理：PTEN可能對HASMC的增殖、遷移等的主要信號傳導(dǎo)通路有類似地影響。本實(shí)驗(yàn)主要側(cè)重于改變表達(dá)PTEN對HASMC遷移的影響。 研究目的 通過攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染人氣道平滑肌細(xì)胞(Human airway smooth muscle cell, HASMC),使腫瘤抑制基因PTEN的過表達(dá)和RNA干擾表達(dá),并以空載腺病毒(Ad-GFP)及空白組(DMEM)作為陰性對照,觀察其對HASMC遷移的影響,并探討其作用機(jī)制。 材料與方法 1、取南方醫(yī)院胸外科同期做肺葉切除術(shù)患者的正常肺葉、段支氣管標(biāo)本,(經(jīng)患者及家屬同意)組織塊貼壁法培養(yǎng)人支氣管平滑肌細(xì)胞(HASMC),取第3-8代細(xì)胞,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。光鏡下觀察和細(xì)胞免疫組化(α-actin)進(jìn)行HASMC鑒定. 2、實(shí)驗(yàn)分為四組：(1)利用攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒(Ad-GFP-PTEN)轉(zhuǎn)染HASMC,實(shí)現(xiàn)PTEN的過表達(dá)；(2)針對PTEN基因的腺病毒短發(fā)夾狀RNA(shRNA)載體(Ad-GFP-shRNA-PTEN)轉(zhuǎn)染HASMC,實(shí)現(xiàn)PTEN的干擾表達(dá)；(3)以感染空載腺病毒(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染HASMC; (4)只加入無血清培養(yǎng)基的空白組(DMEM)作為對照。重組腺病毒感染HASMC:選擇處于對數(shù)生長期的HASMC,加入用無血清的DMEM稀釋的病毒液,置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育,4h后補(bǔ)加含有血清的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育24h后,更換完全培養(yǎng)基,通過在倒置熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效果。并用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)確立最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI, multiplicity of infection)。 3、通過Transwell趨化小室和細(xì)胞劃痕試驗(yàn)(Wound healing assay)檢測四組(Ad-GFP-PTEN、Ad-GFP-shRNA-PTEN、Ad-GFP、DMEM) HASMC的跨膜遷移能力和橫向遷移能力的變化。其中劃痕實(shí)驗(yàn)測量HASMC距離應(yīng)用圖像處理軟件Image J. 4、Western blot法檢測PTEN蛋白的表達(dá)和AKT、ERK1/2通路的活化情況,檢測相應(yīng)信號通路在細(xì)胞遷移中的蛋白表達(dá)的改變,并探討其作用。并加入兩通路的抑制劑(LY294002、U0126)作為陽性對照。 5、應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,用x±s對資料進(jìn)行描述,用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,組間比較采用LSD法。如果方差不齊,應(yīng)用方差近似檢驗(yàn),組件比較用Dunnett's T3檢驗(yàn)。選取檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。圖片處理使用Image J軟件。 結(jié)果 1、應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察,HASMCs未匯合之前多呈梭形或多邊形,內(nèi)有1-2個(gè)細(xì)胞核。細(xì)胞匯合后部分區(qū)域細(xì)胞束狀排列,呈典型“峰、谷”狀。細(xì)胞免疫組化法檢測平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物α-actin,光鏡下可見α-肌動(dòng)蛋白(棕黃色顆粒)在胞質(zhì)內(nèi)均勻分布。 2、用空載病毒載體Ad-GFP轉(zhuǎn)染HASMC,在25、50、100、150、200不同MOI條件下,24小時(shí)流式檢測的轉(zhuǎn)染效率在70%—99%之間,當(dāng)MOI≥100時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到95%以上,趨于穩(wěn)定。因此確定最佳感染復(fù)數(shù)為MOI=100。各組腺病毒均以MOI=100轉(zhuǎn)染HASMC,48h后倒置顯微鏡下觀察,陽性細(xì)胞的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)滿視野。 3、Western blot免疫印跡法法檢測PTEN蛋白的表達(dá)：轉(zhuǎn)染Ad-GFP-shRNA-PTEN后,干擾組PTEN基因表達(dá)減弱；轉(zhuǎn)染Ad-GFP-PTEN后,過表達(dá)組PTEN基因表達(dá)明顯增強(qiáng)；而陰性對照組和空白對照組,PTEN基因的表達(dá)無明顯變化。 4、Western blot免疫印跡法法檢測AKT、ERK蛋白的表達(dá)：與對照組相比,Ad-shPTEN組細(xì)胞p-AKT表達(dá)明顯增高,而Ad-PTEN組細(xì)胞p-AKT的表達(dá)減少,p-AKT抑制劑LY294002作為抑制p-AKT的陽性對照,五組總AKT表達(dá)無明顯差異;與對照組相比Ad-shPTEN組細(xì)胞p-ERK表達(dá)降低,但Ad-PTEN組p-ERK表達(dá)無明顯變化,p-ERK抑制劑U0126作為抑制p-ERK的陽性對照,五組總ERK表達(dá)無明顯差異。 5、Transwell趨化小室法證明與空白對照組(DMEM)(393.78±28.46)和陰性對照組(Ad-GFP)(395.78±51.50)相比過表達(dá)組(Ad-PTEN)(147.89±32.83)能顯著抑制HASMC的遷移活動(dòng)(P=0.000)；而干擾組(Ad-shPTEN)(405.33±81.74)與兩對照組(Ad-GFP、DMEM)相比細(xì)胞遷移活動(dòng)沒有顯著增加,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)；陰性對照組(Ad-GFP)與空白對照組(DMEM)兩者相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000); PI3K/AKT通路抑制劑組(LY294002)(70.56±12.95)作為抑制HASMC遷移的陽性對照組與其他4組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；劃痕修復(fù)法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與transwell法基本相同,再次印證了與兩對照組相比,Ad-PTEN組(121.76±20.66)能抑制HASMC的遷移(P=0.000),而Ad-shPTEN組(236.47±55.14)細(xì)胞遷移活動(dòng)沒有顯著增加(P=0.564vsAd-GFPP=0.229vsDMEM)而Ad-GFP組(225.79±29.52)與DMEM組(258.88±55.06)沒有顯著性差異(P=0.079),LY294002(81.17±14.40)組作為抑制HASMC遷移的陽性對照組與其他4組有顯著性差異(P=0.000vsAd-shPTENAd-GFPDMEM, P=0.033vsAd-PTEN) 結(jié)論 本文通過腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HASMC,使抑癌基因PTEN在細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的過表達(dá)和干擾表達(dá),探討PTEN對HASMC的遷移的影響,并討論其分子信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,得出以下結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)用transwell法和劃痕法檢測細(xì)胞的遷移結(jié)果表明,與兩對照組相比Ad-PTEN組細(xì)胞的遷移也受到了明顯的抑制,因此我們推斷過表達(dá)PTEN基因能通過PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)HASMC的遷移作用。 2、在Ad-shPTEN組干擾PTEN基因表達(dá),p-AKT與p-ERK1/2表達(dá)出現(xiàn)“分離”現(xiàn)象,即p-AKT增加,p-ERK1/2減少;而在Ad-PTEN組p-AKT減少,p-ERK1/2卻沒有改變。根據(jù)既往的文獻(xiàn),這是PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK兩通路的相互聯(lián)系或串?dāng)_,即Cross-talk現(xiàn)象
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)用3一8代HASMC呈典型“峰、谷”狀Fig.1CulturedHASMsdisPlayedaeharaeteristic“hillandvalley，，，apPearanee(x100)

Ad一GFP一PTEN、Ad一GFP一shRNA一PTEN和Ad一GFP轉(zhuǎn)染后GFP表達(dá)F19.4ExpressionofGFPinHASMCsaftertransfeetioninvitro(N[01=100，X200)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳麗麗;羅雅玲;賴文巖;徐健;鐘浩海;張達(dá)成;葉涵;;PTEN基因重組腺病毒對人氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年06期

2 高福生;龍飛;祁卉卉;張軼;金先橋;;反復(fù)吸入煙曲霉孢子對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥和重構(gòu)的影響[J];中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2008年03期

本文編號：2655485