【摘要】： 第一部分血管緊張素Ⅱ及其受體在哮喘大鼠肺組織的表達(dá)及其與氣道炎癥和重塑的關(guān)系 目的:了解血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及其受體在哮喘大鼠肺組織的表達(dá)及其與哮喘氣道炎癥和氣道重塑的關(guān)系。方法:隨機(jī)將20只Wistar大鼠分為對(duì)照組和哮喘組兩組,每組10只。采用OVA腹腔注射致敏、長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)OVA霧化吸入復(fù)制慢性哮喘動(dòng)物模型。觀察大鼠哮喘發(fā)作癥狀;應(yīng)用動(dòng)物肺功能儀測(cè)定大鼠氣道反應(yīng)性(以呼氣相氣道阻力(Re)表示);支氣管肺泡灌洗液(BALF)作細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)BALF上清中TGF-β1、PDGF、VEGF含量;放射免疫分析法(RIA)檢測(cè)BALF上清中AngⅡ水平;常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大體組織病變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);免疫組織化學(xué)檢測(cè)α-SMA染色陽(yáng)性細(xì)胞;應(yīng)用圖像分析軟件測(cè)量大鼠氣道形態(tài)學(xué)變化。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)肺組織血管緊張素Ⅱ受體(AGTR)mRNA表達(dá);蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot analysis)AGTR和STAT-3蛋白水平。結(jié)果:與對(duì)照組相比,哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)以及中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞比例增加(p＜0.05),BALF中TGF-β1、PDGF、VEGF含量明顯增高(p＜0.05～＜0.01);哮喘組較對(duì)照組呼氣阻力(Re)明顯增高(p＜0.05～0.01);在小氣道水平,哮喘組氣道管壁面積/管腔內(nèi)周長(zhǎng)(WAt/Pi)、管壁平滑肌面積/管腔內(nèi)周長(zhǎng)(WAm/Pi)和α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞面積/Pi均明顯大于對(duì)照組(p均＜0.01)。同時(shí),哮喘組BALF中AngⅡ含量高于對(duì)照組,哮喘大鼠肺組織AngⅡ受體(AGTR1,AGTR2)mRNA表達(dá)和蛋白水平明顯增強(qiáng)(p＜0.01);肺組織STAT3蛋白表達(dá)水平在哮喘組明顯增高(p＜0.01)。大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)與AngⅡ含量和肺組織AGTR1mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān),r=0.523、0.724,p＜0.05～0.01;大鼠小氣道Wat/Pi與肺組織AGTR1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān),r=0.671,p＜0.05。結(jié)論:大鼠肺組織局部存在血管緊張素系統(tǒng),AngⅡ及其受體可能參與了哮喘氣道炎癥和氣道重塑。 第二部分血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響 目的:觀察血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響。方法:隨機(jī)將50只Wistar大鼠分為對(duì)照組、哮喘組、纈沙坦干預(yù)組C1、C2、C3組,共5組,纈沙坦干預(yù)組(C1、C2、C3組)和哮喘組予OVA致敏和霧化吸入,霧化吸入隔天1次×30天,C1、C2、C3組分別于每次霧化吸入前60 min予纈沙坦15 mg·kg~(-1)·d~(-1)、30 mg·kg~(-1)·d~(-1)、50 mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃。動(dòng)物肺功能儀測(cè)定大鼠氣道反應(yīng)性;BALF作細(xì)胞分類計(jì)數(shù);ELISA檢測(cè)BALF上清中TGF-β1、PDGF、VEGF含量;RIA檢測(cè)BALF上清中AngⅡ水平;免疫組織化學(xué)檢測(cè)α-SMA染色陽(yáng)性細(xì)胞;圖像分析軟件測(cè)量大鼠氣道形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:纈沙坦明顯降低哮喘大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)以及中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞比例(p＜0.05～＜0.01),減少BALF中TGF-β1、PDGF、VEGF含量(p＜0.05～＜0.01);纈沙坦干預(yù)各組氣道反應(yīng)性明顯低于哮喘組(p＜0.05～＜0.01);纈沙坦干預(yù)組的C2和C3組WAt/Pi較哮喘組明顯減少(p＜0.05);纈沙坦干預(yù)各組(C1、C2、C3組)α-SMA陽(yáng)性面積/Pi在中、小氣道明顯低于哮喘組(p＜0.05～0.01)。但BALF上清中AngⅡ水平隨纈沙坦劑量增加而升高。結(jié)論:血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦可能具有抑制哮喘氣道炎癥和氣道重塑作用。 第三部分纈沙坦對(duì)哮喘大鼠肺組織血管緊張素Ⅱ及其受體表達(dá)的影響 目的:觀察血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦對(duì)哮喘大鼠肺組織中血管緊張素Ⅱ及其受體表達(dá)的影響。方法:隨機(jī)將50只Wistar大鼠分為對(duì)照組、哮喘組、纈沙坦干預(yù)組C1、C2、C3組,共5組,纈沙坦干預(yù)組(C1、C2、C3組)和哮喘組予OVA致敏和霧化吸入,霧化吸入隔天1次×30天,C1、C2、C3組分別于每次霧化吸入前60 min予纈沙坦15 mg·kg~(-1)·d~(-1)、30 mg·kg~(-1)·d~(-1)、50 mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃。RIA檢測(cè)BALF上清和血清中AngⅡ含量;RT-PCR檢測(cè)肺組織TGF-β1mRNA、VEGF mRNA、AGTR1 mRNA和AGTR2 mRNA表達(dá);Western Blot Analysis檢測(cè)AGTR和STAT3蛋白水平;原位雜交法檢測(cè)AGTR1和ATGR2 mRNA在肺組織中分布和表達(dá)。結(jié)果:纈沙坦干預(yù)組的C2組、C3組AngⅡ高于對(duì)照組和哮喘組,尤以C3組增高最為明顯(p＜0.01)。哮喘組AGTR1 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p＜0.01),而纈沙坦干預(yù)組(C1、C2、c3組)AGTR1 mRNA表達(dá)低于哮喘組(p＜0.01);對(duì)照組和C1組AGTR2 mRNA表達(dá)明顯低于哮喘組,C2、C3組AGTR2 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組和C1組,但明顯低于哮喘組(p＜0.05～0.01)。Western blot分析顯示AGTR1蛋白水平結(jié)果與AGTR1 mRNA一致(p＜0.01),但AGTR2蛋白水平在對(duì)照組和C1組未檢測(cè)到,哮喘組AGTR2蛋白水平增高,C2、C3組AGTR2蛋白水平低于哮喘組(p＜0.05)。原位雜交法檢測(cè)顯示AGTR1mRNA表達(dá)在哮喘組明顯強(qiáng)于對(duì)照組和纈沙坦干預(yù)組,AGTR2mRNA在哮喘組和纈沙坦干預(yù)組C3的表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組和纈沙坦干預(yù)組C1、C2。哮喘組TGF-β1 mRNA和VEGF mRNA明顯高于對(duì)照組(p＜0.01),纈沙坦干預(yù)組(C1、C2、C3組)兩者的表達(dá)則低于哮喘組(p＜0.01)。哮喘組STAT3蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p＜0.01),纈沙坦干預(yù)組(C1、C2、C3組)STAT3低于哮喘組(p＜0.01)。哮喘大鼠肺組織AGTR1 mRNA表達(dá)隨纈沙坦劑量增大而減弱,與纈沙坦劑量呈負(fù)相關(guān),r=-0.775,p＜0.01。結(jié)論:AngⅡ通過(guò)AGTR1參與哮喘氣道炎癥和氣道重塑,刺激細(xì)胞因子TGF-β1、VEGF、PDGF和信號(hào)分子STAT3分泌和表達(dá)可能是其部分作用機(jī)制。纈沙坦通過(guò)阻斷AGTR1減輕哮喘的氣道病變,其部分機(jī)制可能與纈沙坦下調(diào)AGTR1表達(dá),降低AngⅡ生物學(xué)效應(yīng),引起反應(yīng)性AngⅡ濃度升高有關(guān),高水平的AngⅡ激動(dòng)了AGTR2,使AGTR2表達(dá)上調(diào),產(chǎn)生潛在的氣道保護(hù)作用。 第四部分血管緊張素Ⅱ?qū)θ梭w氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響及纈沙坦的干預(yù) 目的:觀察AngⅡ?qū)θ梭w氣道平滑肌細(xì)胞(HASMC)增殖的影響以及纈沙坦的抑制作用。方法:體外原代培養(yǎng)HASMC,傳代后給予不同濃度AngⅡ和組織胺(His)刺激,用纈沙坦對(duì)AngⅡ和His作用的HASMC進(jìn)行干預(yù)。以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定細(xì)胞周期和caspase-3表達(dá)。結(jié)果:(1)MTT法顯示,AngⅡ組的吸光度(A_(570))和生長(zhǎng)率明顯高于對(duì)照組和纈沙坦單藥組,以AngⅡ10~(-5)mol/L濃度在第24h為明顯(p＜0.01)。AngⅡ+纈沙坦組的A_(570)和生長(zhǎng)率明顯低于AngⅡ組,纈沙坦的抑制作用在第24h時(shí)最為明顯(p＜0.01),且表現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系,以纈沙坦10~(-3)mol/L的抑制作用最為明顯。(2)FCM分析,與對(duì)照組相比較,AngⅡ10~(-5)mol/L組和His10~(-2)mol/L組的S期百分率明顯升高(p＜0.05～0.01);AngⅡ+纈沙坦組與AngⅡ組相比,S期百分率呈劑量依賴性降低(p＜0.05),可以看出纈沙坦抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的HASMC增殖;His+纈沙坦組與His組相比,顯示了和AngⅡ+纈沙坦組與AngⅡ組類似的結(jié)果(p＜0.05～0.01),提示纈沙坦也可以抑制His誘導(dǎo)的HASMC增殖。(3)AngⅡ+纈沙坦組Caspase-3蛋白表達(dá)強(qiáng)于AngⅡ組。結(jié)論:AngⅡ?qū)ASMC有刺激增殖作用,纈沙坦對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HASMC增殖有抑制作用;纈沙坦可能有促進(jìn)HASMC凋亡作用,纈沙坦促進(jìn)HASMC凋亡可能與caspase-3基因表達(dá)增加有關(guān)。
【圖文】：

行頸靜脈穿刺并固定，氣管切開、插管(Arrow中，.靜脈留置針20G)，固定。然后將大鼠放入體描箱中，連接動(dòng)物呼吸機(jī)和氣管插管，設(shè)置呼吸機(jī)潮氣量6mL爪g，呼吸頻率為80次/min，吸呼比為1:l。先通過(guò)頸靜脈留置針給予生理鹽水靜脈注射，記錄呼氣相氣道阻力(Re)作為基礎(chǔ)值，然后分次按濃度倍增法依次靜脈注射乙酞膽堿，連續(xù)記錄注射乙酞膽堿后Re，每次待Re降至正常后再開始下一個(gè)劑量，所有動(dòng)物均給予以下6個(gè)劑量:10林留kg、20卿kg、40呵kg、80林留kg、160雌kg、320雌kg。結(jié)果以氣道阻力增高率表示，為氣道阻力的實(shí)測(cè)值/基礎(chǔ)值*100171。

行頸靜脈穿刺并固定，氣管切開、插管(Arrow中，.靜脈留置針20G)，固定。然后將大鼠放入體描箱中，連接動(dòng)物呼吸機(jī)和氣管插管，設(shè)置呼吸機(jī)潮氣量6mL爪g，呼吸頻率為80次/min，吸呼比為1:l。先通過(guò)頸靜脈留置針給予生理鹽水靜脈注射，記錄呼氣相氣道阻力(Re)作為基礎(chǔ)值，然后分次按濃度倍增法依次靜脈注射乙酞膽堿，連續(xù)記錄注射乙酞膽堿后Re，每次待Re降至正常后再開始下一個(gè)劑量，所有動(dòng)物均給予以下6個(gè)劑量:10林留kg、20卿kg、40呵kg、80林留kg、160雌kg、320雌kg。結(jié)果以氣道阻力增高率表示，，為氣道阻力的實(shí)測(cè)值/基礎(chǔ)值*100171。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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1 翁學(xué)軍;布地奈德霧化吸入治療兒童咳嗽變異性哮喘療效觀察[J];江蘇醫(yī)藥;2004年01期

本文編號(hào)：2653178