【摘要】： 支氣管哮喘(哮喘)是一種由多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。“Th1/Th2偏移”假說(shuō)被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的主要免疫學(xué)機(jī)制,該假說(shuō)認(rèn)為T(mén)h2細(xì)胞的過(guò)度活化導(dǎo)致了Th2反應(yīng)為主的免疫反應(yīng),Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多在哮喘的氣道炎癥發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。正常人接觸過(guò)敏原后不會(huì)發(fā)生Th2細(xì)胞的過(guò)度活化,這是因?yàn)檎Ｈ丝梢詫?duì)過(guò)敏原產(chǎn)生免疫耐受。而哮喘患者由于免疫耐受缺陷導(dǎo)致接觸過(guò)敏原后T細(xì)胞異�；罨�,增殖和分化為T(mén)h2細(xì)胞,引起“Th1/Th2偏移”,始動(dòng)哮喘的氣道炎癥。 吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase ,IDO)是色氨酸分解代謝的限速酶,可形成局部低色氨酸環(huán)境[6],抑制活化的CD4~+T細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)免疫耐受。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)是目前已知功能最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell, APC),它既是氣道變應(yīng)性炎癥的始動(dòng)因素,也可能是介導(dǎo)免疫耐受的樞紐環(huán)節(jié),在激發(fā)免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受兩方面均起關(guān)鍵作用[7-10]。 本研究應(yīng)用pEGFP-N1-IDO基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染未成熟DC,并觀察IDO基因?qū)β训鞍字旅?激發(fā)小鼠模型CD4~+T細(xì)胞的影響;將pEGFP-N1-IDO基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染未成熟DC移入卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠氣道,觀察對(duì)其氣道炎癥的影響,為臨床防治哮喘提供新的思路。 研究?jī)?nèi)容和方法: 1.小鼠IDO基因的克隆及載體構(gòu)建:RT-PCR法擴(kuò)增IDO cDNA全長(zhǎng)基因序列,并將其克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N1上。 2.未成熟DC的分離、培養(yǎng)和鑒定:體外擴(kuò)增小鼠骨髓來(lái)源的未成熟DC,采用光鏡、掃描電鏡、透射電鏡、流式細(xì)胞技術(shù)鑒定CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86分子。 3.小鼠IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC中目的基因表達(dá)的鑒定:應(yīng)用DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑將pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染未成熟DC,轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,用RT-PCR、Western-blot法鑒定基因轉(zhuǎn)染未成熟DC中目的基因的mRNA和蛋白表達(dá)情況。 4. pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)未成熟DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的影響。 5.建立卵蛋白(OVA)致敏/激發(fā)小鼠模型:腹腔注射OVA和霧化吸入OVA途徑來(lái)致敏/激發(fā)和激發(fā)小鼠,觀察BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù)、BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平,病理切片觀察小鼠肺部氣道炎癥變化。 6. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC對(duì)卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4~+T細(xì)胞增殖、凋亡和分泌細(xì)胞因子的影響:分離卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4~+T細(xì)胞和正常小鼠脾臟CD4~+T細(xì)胞,分別與pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)未成熟DC共培養(yǎng)后,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和TUNEL法檢測(cè)CD4~+T細(xì)胞增殖、凋亡情況,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的變化。 7. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC對(duì)卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠氣道炎癥的影響:將IDO基因轉(zhuǎn)染的未成熟DC經(jīng)氣管注入卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠體內(nèi),病理切片觀察小鼠肺部氣道炎癥變化,進(jìn)行BALF細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù),ELISA檢測(cè)BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平。 結(jié)果: 1.用RT-PCR法成功擴(kuò)增出mIDO cDNA全長(zhǎng)序列,并將其克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N1得pEGFP-N1-IDO,測(cè)序后序列完全正確。 2.獲得小鼠骨髓來(lái)源的未成熟DC。 3.應(yīng)用DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑將pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染未成熟DC后,pEGFP-N1-IDO轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光,而對(duì)照組沒(méi)有綠色熒光,RT-PCR可檢測(cè)到相應(yīng)目的基因mRNA的表達(dá),Western blot法可檢測(cè)到相應(yīng)目的蛋白的表達(dá),而pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組不能檢測(cè)到IDO的mRNA和蛋白的表達(dá)。 4. pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)未成熟DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的表達(dá)無(wú)影響,仍以未成熟型為主。 5.成功建立卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠模型,BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù)增高、BALF中IL-4、IL-5的水平增高和IFN-γ水平降低,病理切片觀察卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠模型病理切片肺部氣道炎癥變化。 6. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟樹(shù)突細(xì)胞能抑制卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠模型CD4~+ T細(xì)胞增殖,pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組CD4~+ T細(xì)胞減少,與和pEGFP- N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟樹(shù)突細(xì)胞可誘導(dǎo)CD4~+ T細(xì)胞凋亡,pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組CD4~+T細(xì)胞凋亡率為15.3%±2.6%,較對(duì)照組和pEGFP- N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組顯著增加(P0.01)。pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-5水平顯著降低,IFN-γ水平顯著升高。 7. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC能顯著地減輕卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠氣道炎癥,減少BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù)、降低BALF中IL-4、IL-5的水平和增高IFN-γ水平。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建IDO基因高表達(dá)的未成熟DC細(xì)胞模型。 2. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC在體外能誘導(dǎo)OVA致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4~+ T細(xì)胞呈低反應(yīng)性,能抑制OVA致敏/激發(fā)小鼠Th2細(xì)胞活化;IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC可誘導(dǎo)CD4~+ T細(xì)胞凋亡。 3. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC在OVA致敏/激發(fā)小鼠體內(nèi)能抑制其Th2細(xì)胞活化,改善變應(yīng)性氣道炎癥,提示IDO基因表達(dá)的上調(diào)可能成為誘導(dǎo)哮喘免疫耐受的作用和機(jī)制之一,為哮喘的治療提供了新的思路。
【圖文】：

14圖 1-1-1 載體 pEGFP-Ｎ1 圖譜B/c 小鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物所。要試劑：物 TaKaRa 公司 日盒 Fermentas 公司 立劑盒 Toyobo 公司 日熱型 KODplusDNA 聚合酶 Toyobo 公司 日 試劑 TaKaRa 公司 日重慶川東化工集團(tuán)有限公司 中 重慶川東化工集團(tuán)有限公司 中 膠回收試劑盒 BioFlux公司 中

-2載體pMD19TVector圖譜
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫鯤,林科雄,吳奎,夏俊波,王長(zhǎng)征;Serrate1基因轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年17期

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本文編號(hào)：2650303