神經(jīng)生長因子啟動哮喘腎上腺髓質(zhì)細胞冗余性致腎上腺素釋放障礙及蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究

發(fā)布時間：2020-05-05 17:00

【摘要】： 背景支氣管哮喘是一種氣道炎癥性疾病，其炎癥發(fā)生與調(diào)控氣道的神經(jīng)系統(tǒng)之間存在復(fù)雜的相互作用。近年來，眾多的實驗證明哮喘狀態(tài)下神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)明顯增高，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘大鼠神經(jīng)生長因子及其受體表達升高，因此，學(xué)術(shù)界越來越關(guān)注氣道神經(jīng)源性炎癥在哮喘發(fā)病中的作用。有研究提示哮喘狀態(tài)下腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞可能存在腎上腺素的合成和(或)釋放障礙，同時外源性NGF可以使腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞向神經(jīng)元方向轉(zhuǎn)化，那么哮喘狀態(tài)下血清中增高的NGF是否對腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞產(chǎn)生形態(tài)上的影響并進而導(dǎo)致其內(nèi)分泌功能的下降?以及具體的機制如何?近來細胞冗余性概念的提出為腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞分化障礙提供了可能的理論支撐點。冗余性是指細胞除了必備的功能外還具有“多于必須”的功能，所謂的細胞可塑性也就是指冗余性在細胞表型上的轉(zhuǎn)分化表現(xiàn)。在非生理情況下，細胞的冗余性功能可能啟動，導(dǎo)致其專職功能下降或消失，而其兼職功能加強。本研究分別通過體內(nèi)和體外實驗探討哮喘狀態(tài)下腎上腺素釋放障礙的可能原因，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法分離和鑒定其中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。第一章支氣管哮喘大鼠腎上腺髓質(zhì)細胞表型改變與NGF表達水平初探目的觀察支氣管哮喘狀態(tài)下大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞(AMCC)形態(tài)學(xué)的改變以及NGF在腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞中的表達。方法利用光鏡觀察哮喘大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞的形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)結(jié)合顯微圖象分析觀察哮喘大鼠髓質(zhì)嗜鉻細胞中NGF的表達變化。結(jié)果HE染色光鏡下觀察都可以見到腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞不同程度的空泡變性樣改變，脂質(zhì)增多，少數(shù)可見纖維樣物質(zhì)伸向皮質(zhì)。與正常對照組(112.23±2.51)相比，哮喘組(121.79±3.24)大鼠NGF免疫陽性反應(yīng)在腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞明顯上調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論支氣管哮喘時腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞NGF的表達增高并出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變，可能導(dǎo)致腎上腺素合成與釋放不足而參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展。第二章神經(jīng)生長因子啟動哮喘大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞冗余性致腎上腺素釋放障礙目的探討支氣管哮喘(簡稱哮喘)狀態(tài)下腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞釋放腎上腺素不足的可能原因，明確神經(jīng)生長因子(NGF)在哮喘發(fā)病機制中的作用。方法雄性SD大鼠40只，隨機分為對照組、哮喘組、NGF干預(yù)組、抗NGF抗體干預(yù)組、SP組，每組8只，分別干預(yù)各組大鼠。電鏡觀察腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞超微結(jié)構(gòu)的改變，免疫組織化學(xué)結(jié)合顯微圖像分析各組大鼠髓質(zhì)嗜鉻細胞中苯乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PNMT)的表達變化，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測各組大鼠血清中腎上腺素和去甲腎上腺素的變化。結(jié)果電鏡觀察可見：(1)哮喘組、NGF組和抗NGF抗體干預(yù)組大鼠腎上腺髓質(zhì)細胞線粒體增多，并且嗜鉻顆粒減少；(2) NGF組腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞膜可見杵狀和絨毛狀突起。圖像分析結(jié)果顯示NGF組PNMT平均灰度值(A)為218±38，與對照組(182±25)、哮喘組(198±33)、抗NGF組(195±41)和SP組(195.46±39.82)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為23.42、19.76、17.93、18.21，，P均＜0.05)；ELISA結(jié)果顯示NGF組血清腎上腺素濃度為(2.9±0.5)ng／ml、與對照組[(7.1±0.4) ng／ml]、哮喘組[(5.9±1.7)ng／ml]、抗NGF組[(5.7±0.6)ng／ml]和SP組[(5.91±1.58)ng／ml]比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為7.64、5.41、4.96、5.12 P均＜0.01)，哮喘組與對照組比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.64，P＜0.01)，哮喘組和抗NGF組腎上腺素水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.87，P＞0.05)。結(jié)論NGF通過啟動腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞的功能冗余性使其表型和功能發(fā)生轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腎上腺素水平下降而參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展。第三章神經(jīng)生長因子啟動原代培養(yǎng)的腎上腺髓質(zhì)細胞功能冗余性致腎上腺素釋放障礙目的觀察NGF等對原代培養(yǎng)的腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞生物行為學(xué)的影響，探討可能的機制。方法采用單細胞消化法原代培養(yǎng)腎上腺髓質(zhì)細胞，密度梯度離心和差速貼壁法分離和純化腎上腺髓質(zhì)細胞。相差顯微鏡、電鏡觀察外源性NGF、SP作用下腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變，ELISA法檢測培養(yǎng)上清夜中腎上腺素和去甲腎上腺素濃度的變化。結(jié)果NGF干預(yù)后2天相差顯微鏡下可見腎上腺髓質(zhì)細胞膜表面漸漸長出長絲狀突起。電鏡下NGF干預(yù)后可見腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞表面豐富的杵狀和絨毛狀突起，近細胞膜處可見小囊泡形成，細胞漿內(nèi)線粒體豐富，結(jié)構(gòu)較模糊，部分嵴丟失。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)NGF干預(yù)后培養(yǎng)上清液中腎上腺素濃度較正常組明顯降低(P＜0.05)，去甲腎上腺素濃度沒有明顯改變。SP干預(yù)后腎上腺素和去甲腎上腺素濃度沒有明顯改變。結(jié)論NGF通過啟動腎上腺髓質(zhì)細胞功能冗余性使其表型和功能發(fā)生改變致腎上腺素合成和釋放障礙。第四章NGF啟動腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞冗余性的蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究目的初步明確NGF啟動腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞冗余性過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，為支氣管哮喘的進一步的治療提供新的思路和可能的治療靶點。方法運用二維凝膠電泳、質(zhì)譜分析法并結(jié)合生物信息學(xué)方法分離和鑒定NGF干預(yù)后的差異蛋白質(zhì)。結(jié)果二維凝膠電泳獲取腎上腺髓質(zhì)細胞正常組和NGF干預(yù)組的平均蛋白質(zhì)點數(shù)為752±34和693±46，NGF干預(yù)組出現(xiàn)有意義的表達上調(diào)的點為48個，下調(diào)點為37個，隨機選取14個表達上調(diào)，6個表達下調(diào)的差異蛋白質(zhì)點進行MOLDI-TOF質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜鑒定獲得了17張較好的肽質(zhì)量指紋圖譜。本實驗通過Mascot軟件檢索MSDB數(shù)據(jù)庫和Profound軟件檢索MSDB數(shù)據(jù)庫初步鑒定17個可能與NGF啟動腎上腺髓質(zhì)細胞冗余性致腎上腺素釋放障礙過程中相關(guān)的差異表達蛋白質(zhì)，其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Rho GDP dissociation inhibitor(GDI) alpha、分子伴侶蛋白HSP27、外周蛋白中間絲蛋白(Peripherin intermediatefilament protein)可能在此過程發(fā)揮重要作用。結(jié)論RhoGDIα蛋白、分子伴侶蛋白HSP27、外周蛋白中間絲蛋白可能在NGF啟動腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞冗余性過程中發(fā)揮重要作用。
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