【摘要】： 目的與意義:支氣管哮喘(哮喘)是一種嚴重危害人類健康的疾病,流行病調查顯示其發(fā)病率及病死率在世界各地呈上升趨勢。目前認為哮喘的病因及發(fā)病機制是由遺傳基因與環(huán)境因素相互作用的結果。環(huán)境因素中主要包括吸入物、感染、食物以及一些藥物。近年來研究發(fā)現(xiàn)病毒感染后哮喘的發(fā)病率上升,成人中以鼻病毒常見,兒童中以呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus RSV)最為常見。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)單純的RSV感染不能直接導致哮喘發(fā)生,但RSV感染后,患者再次接觸過敏原,則可能出現(xiàn)哮喘。因此本實驗的目的是通過RSV感染結合OVA霧化吸入建立豚鼠哮喘動物模型,研究RSV誘發(fā)哮喘中神經機制的作用。 方法:①以Hep-2細胞培養(yǎng)呼吸道合胞病毒,根據細胞病變效應程度和TCID50實驗結果選擇合適毒力的RSV接種豚鼠。健康、體重250~300 g的雌性豚鼠50只,隨機分為6組:Hep-2滴鼻(NS)組、RSV滴鼻(RSV)組、Hep-2滴鼻/鹽水霧化(Hep-2/NS)組、RSV滴鼻/NS霧化組(RSV/NS組)、Hep-2滴鼻/OVA霧化(Hep-2/OVA)組、RSV滴鼻/OVA霧化(RSV/OVA)組。所有動物在乙醚輕微麻醉下以TCID50=5×10-5.5的RSV懸液250μl或者相同條件的Hep-2細胞培養(yǎng)液滴鼻吸入,第2日以相同劑量加強1次。 ②第7日,NS組和RSV組的豚鼠,通過二道生理記錄儀和電刺激迷走神經法檢測并記錄兩組氣道內壓力(Intra-airway pressure, IP mmH2O)。然后依次靜脈給予0.1、1、10、100μg/kg濃度的選擇性M_2受體激動劑匹羅卡品,檢測IP的變化,根據IP的變化程度評估氣道膽堿能神經突觸前膜自身抑制性M_2受體功能。以10 ml生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗,收集肺泡灌洗液中細胞,常規(guī)吉姆薩染色,行細胞分類計數,觀察RSV感染對肺臟的炎癥影響。以RSV組豚鼠為對照組。 ③第7日, Hep-2/NS組、RSV/NS組、Hep-2/OVA組和RSV/OVA組豚鼠接受1%OVA或者生理鹽水霧化吸入30 min ,隔日1次,持續(xù)2 wk,建立哮喘模型。通過肺組織HE染色并計數粘膜與粘膜下細胞總數和嗜酸性粒細胞數目以檢驗哮喘模型是否成功。 ④第21日以相同的方法檢測氣道反應性和M_2受體功能,行膽堿能神經纖維免疫組化并計數陽性纖維數目以進一步研究其發(fā)病機制。以Hep-2/NS組豚鼠為對照組。 結果:①第7日,未刺激迷走神經時,NS組和RSV組豚鼠的IP分別為11.08±1.02 mmH2O和11.75±1.47 mmH2O,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。給予電刺激后,兩組IP均呈頻率依賴性增高,且RSV組明顯高于NS組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。依次給予0.1、1、10、100μg/kg濃度的匹羅卡品后,NS組IP呈劑量依賴性降低,而RSV組IP下降幅度明顯低于NS組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。支氣管肺泡灌洗液的細胞分類計數結果顯示RSV組中細胞總數,單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞數目均明顯高于NS組,差異有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。 ②第21天,HE染色顯示RSV/OVA組豚鼠的肺組織出現(xiàn)明顯的炎癥細胞浸潤,氣管收縮,氣道分泌物增多等表現(xiàn),氣道粘膜和粘膜下嗜酸性粒細胞數目明顯增多,符合哮喘的病理改變。 ③氣道反應性和M_2受體功能:未刺激迷走神經時,Hep-2/NS組、RSV/NS組、Hep-2/OVA組和RSV/OVA組的IP分別為10.46±1.55 mmH2O、10.2±1.37 mmH2O、12.11±1.88 mmH2O和16.23±2.28mmH2O,各組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。給予電刺激后,各組IP均呈頻率依賴性增高,RSV/NS組與Hep-2/NS組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),Hep-2/OVA組IP明顯高于Hep-2/NS組和RSV/NS組(均P 0.05), RSV/OVA組IP明顯高于Hep-2/OVA組(P0.05)。依次給予0.1、1、10、100μg/kg濃度的匹羅卡品后,Hep-2/NS組、RSV/NS組和Hep-2/OVA組IP呈劑量依賴性降低,但Hep-2/OVA組IP下降幅度明顯低于Hep-2/NS組和RSV/NS組(均P0.05)。RSV/OVA組IP無明顯下降,高于Hep-2/OVA組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。平滑肌層有膽堿能陽性纖維分布:RSV/NS組與Hep-2/NS組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),Hep-2/OVA組陽性纖維數目明顯高于Hep-2/NS組和RSV/NS組(P0.05),但RSV/OVA組與Hep-2/OVA組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論:①RSV急性感染導致氣道副交感神經自身抑制性M_2受體功能障礙,引起氣道高反應性發(fā)生。并引起以中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤為主要表現(xiàn)的炎癥反應。 ②RSV感染結合OVA霧化可導致豚鼠肺組織出現(xiàn)哮喘的病理改變。 ③RSV感染末期氣道反應性以及氣道M_2受體功能恢復正常。但可以促進OVA引起的豚鼠AHR發(fā)生,其機制可能是進一步促進OVA霧化吸入導致的氣道自身抑制性M_2受體功能障礙,從而加劇氣道高反應性。OVA可導致氣道平滑肌層膽堿能陽性纖維分布增多,但RSV感染對其分布增多無明顯影響。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R562.25

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本文編號：2649570