發(fā)布時間：2020-04-28 10:05

【摘要】： 目的 間質(zhì)性肺疾病(Interstitial Lung Disease，ILD)近年來發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，晚期肺纖維化是共同結(jié)局。該疾病發(fā)病率為3-6／10萬，其中50％的IPF病人在確診后4-5年死亡，死亡率與肺癌相似，嚴重威脅人群健康和影響生活質(zhì)量。因此，積極研究肺纖維化發(fā)生機制，探索防治肺纖維化新途徑，已成為肺科學(xué)界研究的熱點和難點。盡管肺纖維化發(fā)病機制目前尚不完全清楚，但隨著細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究不斷深入，對肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展機制有了許多新得認識，肺纖維化機制的研究正逐漸走向整體化和多學(xué)科交叉方向。 Wnt信號途徑是發(fā)育生物學(xué)中的重要信號分子，它在哺乳動物肺臟發(fā)育中起重要作用�；蚯贸龑嶒炞C實：Wnt2a基因敲除鼠沒有發(fā)育出肺臟的輪廓；Wnt5a基因敲除鼠在肺臟發(fā)育后期無法最后完成肺臟成熟，小鼠因此而死亡。 許多證據(jù)表明β-catenin(β-連環(huán)素)活化促進纖維化疾病的發(fā)生。侵襲性纖維瘤病是一種良性克隆性纖維細胞增生疾病，在散發(fā)病人的組織病理切片中發(fā)現(xiàn)β-catenin向細胞核內(nèi)濃聚，即向核內(nèi)轉(zhuǎn)移啟動下游基因轉(zhuǎn)錄。文獻報道IPF病人受損支氣管基底細胞和損傷部位Ⅱ型上皮細胞中發(fā)現(xiàn)β-catenin向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。肺纖維化研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號下游效應(yīng)基因—MMP-7直接參與了肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。Wnt／β-catenin信號和TGF-β通路存在多個環(huán)節(jié)相連通，TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子β，TGF-β)可以直接激活TCF／LEF(T cell factor／lymphoid enhancer factor，TCF／LEF)轉(zhuǎn)錄目的基因。因此，本課題擬利用基因轉(zhuǎn)染、RT-PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)和蛋白印跡(Western Blotting，WB)等實驗技術(shù)探討β-catenin對成纖維細胞有何作用及作用機制。 方法 利用cDNA文庫經(jīng)PCR擴增獲得人截短beta catenin基因，構(gòu)建質(zhì)粒SCAT—pcDNA3.0；利用Sofast轉(zhuǎn)染試劑將SCAT—pcDNA3.0質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人胚肺成纖維細胞(HELF)，，收集細胞分別在mRNA和蛋白水平觀察如下指標：游走性，膠原Ⅰ、Ⅲ合成量，α平滑肌肌動蛋白、上皮鈣粘連蛋白、MMP-7合成狀態(tài)。結(jié)果分析以電泳條帶上灰度值作為表達產(chǎn)物水平的參數(shù)。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。顯著檢驗水準α值取0.05。 結(jié)果 用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物并回收該片段。將該片段連接到同樣被KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切的pcDNA3.0載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌，挑取陽性克隆進行質(zhì)粒提取，進行酶切鑒定，并獲得陽性克隆。重組質(zhì)粒測序分析結(jié)果與Genebank內(nèi)β-catenin序列比較，結(jié)果表明沒有錯配。 使用轉(zhuǎn)染試劑Sofast將構(gòu)建成功表達質(zhì)粒、pcDNA3.0質(zhì)粒及對照質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染入人胚肺成纖維細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察對照組出現(xiàn)綠色熒光。RT-PCR及Western Blot檢測β-catenin及新霉素抗性基因表達顯示：正常細胞及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細胞有少量β-catenin表達，而轉(zhuǎn)染SCAT—pcDNA3.0質(zhì)粒的HELF細胞有強烈的β-catenin表達；新霉素抗性基因在HELF細胞中無表達，但在轉(zhuǎn)染空載體和轉(zhuǎn)染SCAT—pcDNA3.0質(zhì)粒的HELF細胞中有較強的表達。 轉(zhuǎn)染SCAT—pcDNA3.0HELF細胞合成膠原Ⅰ較HELF細胞及轉(zhuǎn)染空載體細胞增加，而膠原Ⅲ的合成在轉(zhuǎn)染空載體細胞及HELF細胞有較小區(qū)別，但在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細胞中有較高表達。Wnt／β-catenin下游基因MMP-7(matrix metalloproteinas 7／matrilysin，MMP-7)，cyclin D1表達增加，MMP-9(matrix metalloproteihas 9)表達沒有變化。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒HELF細胞合成a-SMA(a平滑肌蛋白，a-SMA)增加，但E-cadherin(上皮型鈣粘連素，E-cadherin)合成明顯減少。 轉(zhuǎn)染SCAT—pcDNA3.0細胞游走性明顯增加。 結(jié)論 1．β-連環(huán)素促進膠原合成在肺纖維化發(fā)生中起一定作用。 2．β連環(huán)素通過高表達MMP-7、cyclin D_1、a-SMA、降低上皮型鈣粘連素表達發(fā)揮致肺纖維化作用。 3．β連環(huán)素增加成纖維細胞游走性促進肺纖維化發(fā)生。
【圖文】：

上圖紅色箭頭所指為目的基因片斷(2.okb)，另一條帶為線性載體(5.4kb)

SP6方向測序圖譜，下為測序序列結(jié)果AI’l’IAGGTGACAC毛燈’AGA戶JAGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGTCAG毛燈，CAAACCAGGCCAGCTG八JTGCTGTCACCTGGAGGCAGCTGAGGTCCTGGGCATGCCCCAGATCTGGCAGCCCATCAACTGGATACCAGGGTGGTGGCCACCCATCTCATGTTCCATC八TGGGGTCCATGCATCCTGGCC戌彩汀CCACCAGAGTGAAAAGAACG戶J人GCI’AGG，GGCGA異汀CCAAGGGGITCTCCCTGGGCACCAA刀汀CAAGTCCAAAGTCTCATTCCAAGCCATTGGCTCTGI，TCTGAAGAGAGAGCTGGTACI，GAAAGCCG’l’l’l’C’I’l’Gl’A八TCTTGTGGCTTGTCCTCAGACATI，CAAACAGCAGCTGCALAI，GTCGCCACACCTTCAI，1，CCTAGAGTGAATGTCAGAGGAGCTGTGGCTCCCTCAGCTTCA戶JAGCTTCTGCAGCTCCI，GAGCAAGTTCACAGAGGACCCCI，GCAGCI’ACTC『l’I一l’GGATG
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R563

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本文編號：2643334