【摘要】：研究背景:急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是在疾病、外傷、感染等多種因素的影響下,使肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肺內(nèi)氣血屏障發(fā)生病理性血管通透性增加,導(dǎo)致的急性呼吸功能不全。ALI是多因素參與、多基因調(diào)控的復(fù)雜性疾病,患者死亡率較高。因此深入研究ALI的發(fā)病及損傷修復(fù)機(jī)制對(duì)于該病的防治具有重要意義。利用基因芯片檢測(cè)ALI肺組織基因表達(dá)變化能夠全面認(rèn)識(shí)該病的發(fā)病過(guò)程,有助于識(shí)別ALI發(fā)病過(guò)程中涉及的關(guān)鍵分子機(jī)制。本研究第一部分利用基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析的方法探討了ALI肺組織的基因表達(dá)譜,結(jié)果表明ALI中胰島素信號(hào)與肺上皮細(xì)胞的凋亡、增殖和遷移等生物學(xué)活性存在顯著的相關(guān)性。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin growth factor-1,IGF-1)是一類具有生長(zhǎng)作用的多肽類物質(zhì),和胰島素同屬于Insulin/IGF家族,具有十分相似的結(jié)構(gòu)和功能,參與胰島素信號(hào)調(diào)控機(jī)體多種生物學(xué)過(guò)程。已有的研究表明IGF-1在ALI肺組織損傷及修復(fù)過(guò)程中扮演著重要角色,但具體的分子機(jī)制不清。肺泡上皮細(xì)胞的受損凋亡是影響肺泡氣體交換,引起呼吸功能不全的重要原因;促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的增殖、遷移加快組織修復(fù)是治療ALI,改善低氧血癥和呼吸功能的重要機(jī)制。因此,探討IGF-1對(duì)肺泡上皮細(xì)胞凋亡、增殖和遷移等生物學(xué)行為的影響,對(duì)深入了解ALI的發(fā)病機(jī)制及尋找潛在的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。目的:第一部分:共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析探討與ALI肺上皮細(xì)胞生物學(xué)活性相關(guān)的主要信號(hào);第二部分:IGF-1對(duì)肺泡上皮細(xì)胞MLE-12增殖、遷移和凋亡的影響。方法:第一部分:(1)從Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取公開發(fā)布的小鼠ALI肺組織和正常肺組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣;(2)將下載的數(shù)據(jù)集載入R軟件后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,通過(guò)limma包獲取差異表達(dá)的基因,篩選標(biāo)準(zhǔn)為P0.05,log2FoldChange(log2FC)0.5;(3)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)差異基因顯著性基因模塊,及其與肺上皮細(xì)胞凋亡、增殖和遷移功能的主要聯(lián)系;(4)利用基因注釋和功能富集分析,對(duì)差異基因的生物過(guò)程、分子功能及細(xì)胞成分進(jìn)行富集分析,探索肺上皮細(xì)胞凋亡、增殖和遷移特性的變化。第二部分:(1)Western blot檢測(cè)ALI小鼠肺組織勻漿中IGF-1蛋白分子的動(dòng)態(tài)變化。(2)將培養(yǎng)的MLE-12細(xì)胞分為對(duì)照組(Control),IGF1組,LPS組,LPS+IGF1組,IGF1+PI3K信號(hào)阻斷組;(3)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組MLE-12細(xì)胞凋亡情況與細(xì)胞周期變化;(4)采用MTT法檢測(cè)各組MLE-12細(xì)胞增殖情況;(5)通過(guò)細(xì)胞遷移試驗(yàn)(劃痕試驗(yàn))觀察MLE-12細(xì)胞在不同時(shí)間段(0h,12h,24h,48h)細(xì)胞遷移數(shù)量的變化。結(jié)果:第一部分:(1)根據(jù)差異基因分析結(jié)果,本研究共獲取434個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因和329個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因(P0.05,log2FC0.5);(2)根據(jù)WGCNA進(jìn)行分析,結(jié)果獲得的2個(gè)主要基因模塊(藍(lán)色和天藍(lán)色),其富集分析功能主要包括LPS、細(xì)菌源性產(chǎn)物、TNF及外界刺激引起的免疫與炎癥反應(yīng)(ID:0032103、0032496、0034612、0050727),以及肺上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生和對(duì)損傷的修復(fù)(ID:0061138、0001763、0048754、0042060)。(3)基因模塊功能網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),與肺上皮細(xì)胞功能(增殖、遷移、凋亡)有關(guān)的核心基因主要包括HIF1a、CCL2、CCL5、STAT5a、PNP、PYCARD、BCL10、NFE2L2、TEK、HSPB1、SAV、DAB2、EPHA2、TNF、DLL1、CCL11、AREG、CEBPB和MMP14等。(4)胰島素途徑在ALI中能夠顯著影響肺泡上皮細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡功能,積極參與肺組織損傷的修復(fù)過(guò)程,此外還包括PI3K/Akt(ID:1257604,6811558,389357)、MAPK(ID:0043410)和 ERK1/ERK2(ID:0070372)級(jí)聯(lián)調(diào)控的生物過(guò)程及胰島素分泌途徑。第二部分:(1)經(jīng)過(guò)蛋白印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在LPS氣道滴入24h后小鼠模型的肺組織勻漿中,IGF-1蛋白表達(dá)顯著性升高。(2)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),IGF-1能夠通過(guò)PI3K途徑抑制或減緩MLE-12細(xì)胞的凋亡,減少M(fèi)LE-12細(xì)胞凋亡比例,尤其是顯著性降低細(xì)胞晚期凋亡的發(fā)生。(3)IGF-1可以通過(guò)P3K信號(hào)通路提高M(jìn)LE-12細(xì)胞活力,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。(4)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IGF-1可以通過(guò)PI3K信號(hào)通路促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞遷移。結(jié)論:(1)胰島素信號(hào)在ALI小鼠中與肺上皮細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)活性存在顯著的相關(guān)性。(2)IGF-1通過(guò)PI3K途徑抑制肺泡上皮細(xì)胞MLE-12的凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。
【圖文】：

圖 1. 差異表達(dá)基因的火山圖及熱圖.（A：差異表達(dá)基因的火山圖，，每個(gè)紅點(diǎn)代表一個(gè)高表達(dá)的基因，每個(gè)藍(lán)點(diǎn)代表低表達(dá)的基因，黑色的點(diǎn)代表表達(dá)水平不顯著的基因；B：差異表達(dá)基因的熱圖，紅色代表高表達(dá)的基因，藍(lán)色代表低表達(dá)的基因，圖例的灰度值代表不同的表達(dá)水平。）2.構(gòu)建DEGs基因模塊根據(jù)無(wú)監(jiān)督拓?fù)錁?biāo)準(zhǔn)和動(dòng)態(tài)剪切樹參數(shù)（剪切深度=2，剪切高度=0.95，最小模塊=50，軟閾值效能β=10），將篩選的 763 個(gè) DEGs 劃分為 5 個(gè)模塊（圖 2A），圖中每個(gè)垂直的短線（枝葉）代表一個(gè)基因，其中灰色模塊中的基因代表剪切后不能聚集的部分；如表1所示，描述了其他四種模塊的基因數(shù)量、偽 R2、模塊內(nèi)兩組基因表達(dá)水平的對(duì)比結(jié)果（包括顯著性檢驗(yàn)的 P 值和熱圖，其中黃色代表高表達(dá)的基因，紅色代表低表達(dá)的基因）。圖2B為所有模型間的 ANOVA 檢驗(yàn)結(jié)果，P=6.4e-35，表示結(jié)果具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖 2C 為基因模塊間的 Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，該模型所有模塊間的 Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果 P = 1.6e-38。圖 2D為對(duì)聚集的四種模型進(jìn)行維度分析，亦是主成分分析（Principal Component

主要模塊基因富集功能分析結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R563

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