【摘要】：目的: 免疫組化法檢測(cè)大鼠細(xì)胞增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene, rHSG)蛋白在正常及慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)大鼠氣道成纖維細(xì)胞細(xì)胞中的不同表達(dá);通過(guò)體外轉(zhuǎn)染(Homo hyperplasia suppressor gene,hHSG)基因至COPD氣道成纖維細(xì)胞中,觀察pEGFP-hHSG對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響,為進(jìn)一步基因治療打下理論基礎(chǔ)。 方法: 通過(guò)制造COPD大鼠模型,組織塊法培養(yǎng)氣道成纖維細(xì)胞,用免疫組化檢測(cè)rHSG基因在正常大鼠和COPD大鼠氣道成纖維細(xì)胞中的表達(dá);感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pEGFP-n1、pEGFP-hHSG,堿裂解法抽提質(zhì)粒,經(jīng)電泳及DNA測(cè)序鑒定,然后通過(guò)脂質(zhì)體法將pEGFP-hHSG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COPD患者氣道成纖維細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況,轉(zhuǎn)染后用免疫組化檢測(cè)空白對(duì)照組(COPD未轉(zhuǎn)染組)、轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組、轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組中hHSG蛋白的表達(dá),MTT、細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。應(yīng)用SPSSll.O軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以?x±s表示。均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間q檢驗(yàn), P0.05為差別有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: COPD造模成功后,經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng),免疫組化學(xué)結(jié)果顯示rHSG蛋白在COPD大鼠組和正常大鼠組中皆有表達(dá),其灰度值分別113.796±13.173、184.327±3.238,rHSG基因在COPD大鼠氣道成纖維細(xì)胞中表達(dá)明顯低于正常大鼠氣道成纖維細(xì)胞中的表達(dá),兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。原代培養(yǎng)正常人和COPD患者氣道成纖維細(xì)胞,抗波形蛋白鑒定實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞為成纖維細(xì)胞,時(shí)差法純化得到純氣道成纖維細(xì)胞;氯化鈣法制備得到高轉(zhuǎn)化率的感受態(tài)細(xì)胞(DH5a), pEGFP-n1、pEGFP-hHSG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增,EcoI和SnaBI酶雙酶切電泳鑒定得到片段長(zhǎng)度約為2274bp的基因片段,測(cè)序結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒中含有hHSG基因編碼區(qū),其片段長(zhǎng)為2274bp。經(jīng)GeneBank Blast分析證實(shí)DNA插入序列與目的片段DNA序列完全完全一致。將pEGFP-n1、pEGFP-hHSG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至COPD氣道成纖維細(xì)胞中,在銀光顯微鏡可見(jiàn)轉(zhuǎn)染組(pEGFP-n1、pEGFP-hHSG)細(xì)胞中皆有綠色熒光蛋白基因(GFP)的表達(dá),其主要位于細(xì)胞核周圍。通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)得hHSG在空白組對(duì)照、pEGFP-n1、在pEGFP-hHSG三組細(xì)胞的細(xì)胞核及核周均呈現(xiàn)不同程度的陽(yáng)性反應(yīng),其中空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)和轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組陽(yáng)性反應(yīng)較弱,而轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)較強(qiáng),空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組與轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組所測(cè)灰度值比值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明hHSG在這些細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)。細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT并描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,結(jié)果示轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組細(xì)胞增殖受到明顯抑制,而空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組細(xì)胞增殖無(wú)明顯改變。轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組在第1、2、3、4、5天對(duì)COPD氣道成纖維細(xì)胞增殖的抑制率分別為24.6% ,28.7% ,43.6% ,52.3%和62% ,且抑制率與時(shí)間呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組與空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組之間有明顯差異(P0.05),而轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組與空白對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。 結(jié)論: rHSG基因在COPD大鼠氣道成纖維細(xì)胞中表達(dá)明顯低于正常大鼠氣道成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。體外轉(zhuǎn)染hHSG至COPD患者氣道成纖維細(xì)胞后,hHSG在細(xì)胞核周邊穩(wěn)定表達(dá),細(xì)胞增殖受到明顯抑制。
【圖文】：

的 COPD 病理改變（見(jiàn)圖 1、2，3），提示造模成功。圖 1 COPD 模型組大鼠 200× 支氣管腔里見(jiàn)大量分泌物及炎性細(xì)胞，管壁的周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞增多，包體增大。

圖 1 COPD 模型組大鼠 200× 支氣管腔里見(jiàn)大量分泌物及炎性細(xì)胞，管壁的周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞增多，，包體增大。圖 2 COPD 模型組大鼠 400× 可見(jiàn)支氣管壁淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管粘膜上皮纖毛倒伏或脫落，杯狀細(xì)胞明顯增多，包體增大。
【學(xué)位授予單位】：貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R563.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2637400