【摘要】：目的: 免疫組化法檢測大鼠細胞增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene, rHSG)蛋白在正常及慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)大鼠氣道成纖維細胞細胞中的不同表達;通過體外轉(zhuǎn)染(Homo hyperplasia suppressor gene,hHSG)基因至COPD氣道成纖維細胞中,觀察pEGFP-hHSG對成纖維細胞增殖的影響,為進一步基因治療打下理論基礎(chǔ)。 方法: 通過制造COPD大鼠模型,組織塊法培養(yǎng)氣道成纖維細胞,用免疫組化檢測rHSG基因在正常大鼠和COPD大鼠氣道成纖維細胞中的表達;感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pEGFP-n1、pEGFP-hHSG,堿裂解法抽提質(zhì)粒,經(jīng)電泳及DNA測序鑒定,然后通過脂質(zhì)體法將pEGFP-hHSG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COPD患者氣道成纖維細胞,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況,轉(zhuǎn)染后用免疫組化檢測空白對照組(COPD未轉(zhuǎn)染組)、轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組、轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組中hHSG蛋白的表達,MTT、細胞計數(shù)法觀察轉(zhuǎn)染后細胞生長狀況。應(yīng)用SPSSll.O軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,實驗數(shù)據(jù)以?x±s表示。均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間q檢驗, P0.05為差別有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: COPD造模成功后,經(jīng)過細胞培養(yǎng),免疫組化學(xué)結(jié)果顯示rHSG蛋白在COPD大鼠組和正常大鼠組中皆有表達,其灰度值分別113.796±13.173、184.327±3.238,rHSG基因在COPD大鼠氣道成纖維細胞中表達明顯低于正常大鼠氣道成纖維細胞中的表達,兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。原代培養(yǎng)正常人和COPD患者氣道成纖維細胞,抗波形蛋白鑒定實驗所得細胞為成纖維細胞,時差法純化得到純氣道成纖維細胞;氯化鈣法制備得到高轉(zhuǎn)化率的感受態(tài)細胞(DH5a), pEGFP-n1、pEGFP-hHSG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴增,EcoI和SnaBI酶雙酶切電泳鑒定得到片段長度約為2274bp的基因片段,測序結(jié)果證實質(zhì)粒中含有hHSG基因編碼區(qū),其片段長為2274bp。經(jīng)GeneBank Blast分析證實DNA插入序列與目的片段DNA序列完全完全一致。將pEGFP-n1、pEGFP-hHSG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至COPD氣道成纖維細胞中,在銀光顯微鏡可見轉(zhuǎn)染組(pEGFP-n1、pEGFP-hHSG)細胞中皆有綠色熒光蛋白基因(GFP)的表達,其主要位于細胞核周圍。通過免疫組化方法檢測得hHSG在空白組對照、pEGFP-n1、在pEGFP-hHSG三組細胞的細胞核及核周均呈現(xiàn)不同程度的陽性反應(yīng),其中空白對照組(未轉(zhuǎn)染組)和轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組陽性反應(yīng)較弱,而轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組細胞陽性反應(yīng)較強,空白對照組、轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組與轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組所測灰度值比值具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),說明hHSG在這些細胞中均有不同程度的表達。細胞計數(shù)、MTT并描繪細胞生長曲線,結(jié)果示轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組細胞增殖受到明顯抑制,而空白對照組和轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組細胞增殖無明顯改變。轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組在第1、2、3、4、5天對COPD氣道成纖維細胞增殖的抑制率分別為24.6% ,28.7% ,43.6% ,52.3%和62% ,且抑制率與時間呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組與空白對照組、轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組之間有明顯差異(P0.05),而轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組與空白對照組之間無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論: rHSG基因在COPD大鼠氣道成纖維細胞中表達明顯低于正常大鼠氣道成纖維細胞中的表達。體外轉(zhuǎn)染hHSG至COPD患者氣道成纖維細胞后,hHSG在細胞核周邊穩(wěn)定表達,細胞增殖受到明顯抑制。
【圖文】：

的 COPD 病理改變（見圖 1、2，3），提示造模成功。圖 1 COPD 模型組大鼠 200× 支氣管腔里見大量分泌物及炎性細胞，管壁的周圍炎細胞浸潤，杯狀細胞增多，包體增大。

圖 1 COPD 模型組大鼠 200× 支氣管腔里見大量分泌物及炎性細胞，管壁的周圍炎細胞浸潤，杯狀細胞增多，，包體增大。圖 2 COPD 模型組大鼠 400× 可見支氣管壁淋巴細胞、漿細胞浸潤，支氣管粘膜上皮纖毛倒伏或脫落，杯狀細胞明顯增多，包體增大。
【學(xué)位授予單位】：貴陽中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R563.9

【參考文獻】

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本文編號：2637400