【摘要】： 目的: 血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell, EC)作為血管壁基本的結(jié)構(gòu)和功能單位,是血管屏障重要的組成部分,生理狀態(tài)下在調(diào)節(jié)血管內(nèi)外物質(zhì)交換、維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用。在損傷因子的作用下,通過(guò)一系列調(diào)控機(jī)制,EC即可發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)以消除致病因子對(duì)機(jī)體的損傷作用,與此同時(shí),EC通過(guò)表型轉(zhuǎn)變參與損傷組織的修復(fù),如炎癥所致的基底膜損傷或斷裂的重建。一旦其調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生異常,則導(dǎo)致形態(tài)和功能的改變,并可能成為各種疾病發(fā)生的主要啟動(dòng)因素之一。肺急性損傷的發(fā)病過(guò)程包括急性肺泡炎期和損傷組織修復(fù)重塑階段,而血管反應(yīng)是炎癥發(fā)生的中心環(huán)節(jié),其中EC緊密連接開放、血管通透性增高是炎癥反應(yīng)的主要表現(xiàn)形式,它不僅為清除損傷因子及壞死組織提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ),而且為損傷組織的重建提供了保證。隨著組織修復(fù)的完成,肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)的功能恢復(fù)正常。但是我們前期研究顯示,博萊霉素(bleomycin, BLM)損傷大鼠PMVECs間緊密連接(tight junction, TJ)卻持續(xù)開放,即使肺間質(zhì)基質(zhì)已過(guò)度沉積,PMVECs的TJ仍未能恢復(fù)正常。這種內(nèi)皮屏障功能的異常為纖維化發(fā)生時(shí)單核細(xì)胞游出并釋放各種致纖維化生長(zhǎng)因子提供了途徑。在PF發(fā)生過(guò)程中,成纖維細(xì)胞(fibroblast, Fb)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast, MFb)是關(guān)鍵的細(xì)胞事件之一。在Fb轉(zhuǎn)化的過(guò)程中,細(xì)胞因子及其形成的網(wǎng)絡(luò)起著重要的作用。我們的前期研究表明,不同致病因子均可引起幾乎相同的細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào),而且在致纖維化過(guò)程中起著重要作用的細(xì)胞因子,如TGF-β1、CTGF、IGF等在正常生理代謝中亦有表達(dá),提示相關(guān)的細(xì)胞因子不僅在致纖維化中有異常表達(dá),而且是細(xì)胞正常生理代謝中不可或缺的調(diào)控因素。已經(jīng)證實(shí),細(xì)胞因子的表達(dá)與細(xì)胞的功能密切相關(guān),如作為血細(xì)胞主要成分之一的單核細(xì)胞并不具備分泌細(xì)胞因子的功能,但當(dāng)其游走至組織間或肺泡時(shí)則轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袕?qiáng)大分泌功能的巨噬細(xì)胞。單核細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變?cè)诳菇M織損傷中起著重要作用。EC是分泌CTGF的細(xì)胞之一,它具有促進(jìn)Fb轉(zhuǎn)化為MFb的作用。在損傷因子作用下,EC間TJ開放意味著其形態(tài)和功能已發(fā)生明確改變,但是BLM損傷大鼠肺EC間的TJ持續(xù)開放似提示PMVECs表型轉(zhuǎn)變的調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂。在此基礎(chǔ)上,表型發(fā)生改變的PMVECs分泌CTGF的功能是否發(fā)生異常,并成為PF形成的主要誘發(fā)因素之一,目前未見報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)光鏡、電鏡、ELISA檢測(cè)法及免疫組織化學(xué)染色等方法,觀察肺炎及PF大鼠肺組織的病理過(guò)程及PMVECs形態(tài)學(xué)改變,比較兩組血清CTGF的含量及時(shí)相變化趨勢(shì)和兩組大鼠肺組織MVECs的CTGF表達(dá)情況,分析BLM損傷大鼠PMVECs形態(tài)、功能的改變與CTGF表達(dá)的關(guān)系,以探討PMVECs表型與PF發(fā)生的關(guān)系。 方法: SD大鼠45只,體重150±20 g,雌雄不拘(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。隨機(jī)分為3組,即BLM組、肺炎鏈球菌組、正常組,每組15只。BLM組用博萊霉素-A5的溶液(天津太河制藥有限公司出品,8 mg/支,批號(hào)040902)用生理鹽水配成4 g/L溶液,按5 mg/kg給藥注入氣管。注入過(guò)程中將大鼠直立、旋轉(zhuǎn),使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻。肺炎組在相同條件下向氣管內(nèi)注入肺炎鏈球菌菌液0.15 mL/只(中國(guó)藥品生物制品檢定所出品,細(xì)菌號(hào)31003,復(fù)蘇繁殖2代,稀釋成菌液,菌落數(shù)3×108/mL)。正常組在相同條件下向氣管內(nèi)注入0.25 mL的生理鹽水,方法同上。分別于給藥后第3,7,14,21和28 d處死大鼠,經(jīng)右室流出道用生理鹽水沖洗致大鼠肺發(fā)白后,取肺組織用10 g/L多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片,HE、VG染色;取少量各組肺組織用3%的戊二醛固定后制作成電鏡標(biāo)本,觀察PMVECs形態(tài)學(xué)改變。ELISA法檢測(cè)各組血清CTGF含量及其時(shí)相變化趨勢(shì)。免疫組織化學(xué)染色采用兩步法檢測(cè)觀察對(duì)比各組大鼠肺間質(zhì)中CTGF在PMVECs中的表達(dá)情況。 結(jié)果: 1、肺炎與BLM組光鏡觀察:肺炎組第3 d肺間質(zhì)內(nèi)見大量炎細(xì)胞,肺泡腔結(jié)構(gòu)消失呈片狀實(shí)變區(qū),第14 d肺通氣基本恢復(fù)正常;BLM組第3 d肺泡腔滲出性改變,肺泡間隔炎細(xì)胞浸潤(rùn),第14 d、21 d肺泡間隔增厚明顯,實(shí)變區(qū)明顯增多,間質(zhì)Fb增多,第28 d肺泡間隔增厚,可見大量膠原纖維。 2、PMVECs超微結(jié)構(gòu)觀察:肺炎組第7 d PMVECs呈增生狀態(tài),緊密連接開放,胞質(zhì)厚度增加,吞飲小泡明顯減少,之后恢復(fù)正常;BLM組PMVECs表面不光整,表面可見指狀突起及血小板粘附,體積增大呈增生狀態(tài),第7、14、21 d細(xì)胞內(nèi)吞飲小泡明顯持續(xù)增多,且緊密連接持續(xù)開放,第28 d PMVECs旁大量膠原沉積。 3、血清CTGF測(cè)定:肺炎組第3 d增高,第7 d驟降,之后恢復(fù)正常(12.06±0.43pg/mL);BLM組第7 d開始增高,第21 d增至高峰(19.45±0.41pg/mL),組間差異明顯(n=15, p0.05),兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、免疫組化染色:BLM組第21 d大鼠肺組織CTGF陽(yáng)性表達(dá)較肺炎組第21 d明顯增高,肺間質(zhì)MVECs的CTGF陽(yáng)性表達(dá)明顯(n=15,p0.05),兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1、BLM可致大鼠PMVECs形態(tài)改變及功能紊亂,PMVECs表型轉(zhuǎn)變是CTGF時(shí)相和量異常表達(dá)的關(guān)鍵因素之一,它可能是BLM所致PF發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。 2、基于PMVECs由“屏障表型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤笆湛s”表型與EC代謝密切相關(guān),[Ca2+]i代謝調(diào)節(jié)功能紊亂可能是EC表型轉(zhuǎn)變及EC異常分泌CTGF的原因之一。
【圖文】：

氣血屏障結(jié)構(gòu)電鏡圖

肺泡結(jié)構(gòu)圖
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R563.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2637053