【摘要】： 第一部分OM和TNF-α抗體拮抗TNF-α對AM凋亡的研究 目的：探討OM和TNF-α抗體拮抗TNF-α對AM凋亡的影響。材料和方法：應用支氣管肺灌洗方法，收集Wistar大鼠的AM，用Eagels培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1*10~6/ml，進行純化培養(yǎng)和刺激培養(yǎng)。實驗分4組：空白對照組；加無血清的Eagles液；100μg/ml石英組：加含100μg/ml石英的Eagles液；100μg/ml石英+10ng/ml抗TNF-α抗體組：在用石英刺激前1h加含10ng/ml抗TNF-α抗體的無血清的Eagles液，1h后補加100μg/50μl石英混懸液100μl；100μg/ml石英+800μg/mlOM組：同樣在用石英刺激前1h加含800μg/mlOM的無血清Eagles液，1h后補加100μg/50μl石英混懸液100μl。每組設(shè)4瓶平行樣品。置37℃、5％CO_2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)刺激培養(yǎng)24h。然后，用Elases法檢測AM培養(yǎng)上清液中TNF-α的含量；用原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)，采用熒光標記法檢測AM凋亡的水平。結(jié)果：TNF-α抗體和OM能明顯降低AM培養(yǎng)上清液中TNF-α的含量，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，P＜0.05。當TNF-α降低以后，能明顯的拮抗TNF-α對AM的凋亡。結(jié)論：1．OM能呈劑量依賴方式拮抗SIO_2對AM分泌TNF-α。2．TNF-α能導致AM凋亡，TNF-α抗體和OM能明顯的拮抗TNF-α對AM的凋亡作用。實驗可能對進一步的認識肺纖維化的發(fā)病機理和對肺纖維化的治療有幫助。 第二部分TNF-α對成纖維細胞增殖的信號轉(zhuǎn)導機制研究 目的：探討TNF-α致成纖維細胞增殖的信號轉(zhuǎn)導機制，為設(shè)計塵肺治療藥物提供分子靶點。材料與方法：應用組織塊法原代培養(yǎng)3天大乳鼠肺成纖維細胞，細胞傳代至4-5代時用于實驗。將4-5代生長良好的細胞分為4組：即5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml三個不同劑量的TNF-α細胞因子組，同時設(shè)有空白對照組，每組設(shè)4瓶平行樣品。指標測定：1．免疫組織化學方法檢測成纖維細胞膜TNF-αR的表達和PKC的表達；2．應用Western blot方法檢測TNF-αRⅠ(P55)和TNF-αRⅡ(P75)的表達；3．應用放射免疫分析方法檢測成纖維細胞IP_3、DAG、cAMP和cGMP的水平；4．應用流氏細胞技術(shù)檢測纖維細胞內(nèi)Ca離子的含量；5．MTT法測定成纖維細胞的增殖水平。結(jié)果：TNF-α能明顯的提高TNF-αR陽性表達率，與對照組比較有明顯的統(tǒng)計學差異。在TNF-α不同劑量組中，尤以10ng/ml TNF-α作用劑量對成纖維細胞TNF-αR陽性表達率最高，與其它三組比較，有統(tǒng)計學顯著性意義。由于TNF-αR有二種，即：TNF-αRⅠ(P55)和TNF-αRⅡ(P75)。在不同的疾病中，TNF-α結(jié)合的受體不同，引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導途徑不一樣，其發(fā)揮的生物學效應也不一樣。為此，應用Western blot方法對其二種受體進行測定，進一步確定TNF-α與哪種受體結(jié)合而起作用。結(jié)果表明：TNF-α主要影響TNF-αRⅡ(P75)的表達，尤其以10ns/mlTNF-α組影響明顯。對TNF-αRⅠ(P55)的表達沒有影響。TNF-α與TNF-αRⅡ結(jié)合后，能使成纖維細胞內(nèi)IP_3和DAG兩信使物質(zhì)呈劑量和時間依賴性增高。IP_3和DAG是細胞內(nèi)重要的第二信使。IP_3可以誘發(fā)細胞內(nèi)Ca的釋放。在三種濃度的TNF-α劑量組中，10ng/mlTNF-α組對細胞內(nèi)Ca釋放的影響最大，這一結(jié)果與TNF-α對膜受體表達的影響水平呈現(xiàn)一致性；與對IP_3的表達水平也基本一致。說明膜受體和IP_3的表達水平可以影響細胞內(nèi)Ca的釋放。DAG和PKC的實驗結(jié)果顯示：PKC的表達水平出奇的與DAG和Ca的表達水平一致。為了進一步證實Ca離子對PKC表達的影響，進行了Ca離子阻斷實驗，在用10ng/mlTNF-α刺激細胞前1h用Ca離子阻斷劑-尼莫地平處理細胞，發(fā)現(xiàn)在Ca離子水平明顯降低的基礎(chǔ)上PKC的表達也較不加Ca離子阻斷劑時有所降低。且阻斷前后有統(tǒng)計學上的差異。cAMP和cGMP的實驗結(jié)果顯示：不同濃度的TNF-α作用成纖維細胞不同時點時，cAMP和cGMP的水平均有變化，有趣的是5ng/ml和20ng/mlTNF-α組cAMP、cGMP水平隨作用時間的延長而增高，但10ng/LmlTNF-α組在作用時間4h時，cAMP的含量明顯增高，而作用時間延長到24h時，卻趨于下降，而該組cGMP水平的變化卻與cAMP相反，cGMP從作用時間4h-24h表現(xiàn)明顯的上升，從而導致10ng/ml TNF-α組cAMP/cGMP的比值明顯低于其它三組。結(jié)合對成纖維細胞增殖效應的實驗結(jié)果綜合分析顯示10ng/ml TNF-α能明顯提高對細胞的增殖水平，與其它三組比較有明顯的統(tǒng)計學差異，P＜0.05。結(jié)論：1．TNF-α與成纖維細胞膜TNF-αRⅡ結(jié)合，激活G蛋白偶聯(lián)的PLC、AC激酶，開通IP_3/Ca、DAG/PKC和cAMP/cGMP信號通路是TNF-α致成纖維細胞增殖的機理之一。2．Ca離子和DAG共同促進PKC的表達，IP_3/Ca和DAG/PKC二條途徑在信號轉(zhuǎn)導的過程中可能共同協(xié)作，引起成纖維細胞的大量增生。3．cAMP/cGMP的比值對成纖維細胞的增殖效應是重要的，當cAMP/cGMP的比值增高時對成纖維細胞的增殖起抑制作用，，反之亦然。4．10ng/ml TNF-α對成纖維細胞的增殖起著關(guān)鍵的作用。 第三部分PGE_2聯(lián)合TNF-α對成纖維細胞增殖的信號轉(zhuǎn)導機制研究 目的：探討TNF-α刺激因子與PGE_2抑制因子聯(lián)合作用時，兩種因子的量比例變化對成纖維細胞信號物質(zhì)的影響。為細胞因子治療塵肺提供科學依據(jù)。材料與方法：應用組織塊法原代培養(yǎng)3天大乳鼠肺成纖維細胞，細胞傳代到4-5代時用于實驗，將4-5代生長良好的細胞分為5組；分為5組：空白對照組；10ng/ml TNF-α；500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml PGE2組。每組設(shè)3個平行樣品。指標測定：1．免疫組織化學方法檢測成纖維細胞膜TNF-αR的表達和PKC的表達；2．應用放射免疫分析方法檢測成纖維細胞IP_3、cAMP和cGMP的水平；3．應用流氏細胞技術(shù)檢測纖維細胞內(nèi)Ca離子的含量；4．MTT法測定成纖維細胞的增殖水平。結(jié)果：PGE_2可以抑制TNF-α對成纖維細胞膜TNF-αR的表達，且隨PGE_2劑量的增加TNF-αR的表達減弱。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，P＜0.05。IP_3實驗結(jié)果表明：當TNF-α聯(lián)合1000pg/ml和2000pg/ml的PGE_2時，IP_3cpm值隨作用時間的增加而增高。尤以1000pg/mlPGE_2組上升明顯，特別是從60s-120s時間段表現(xiàn)陡峭上升。與其它四組比較有高度的統(tǒng)計學差異，P＜0.01；10ng/ml TNF-α聯(lián)合不同劑量的PGE_2在不同時間點對IP_3cpm的變化模式不相同。PGE_2對Ca離子的影響表現(xiàn)為：單獨10ng/ml TNF-α作用時，細胞內(nèi)Ca~(2+)和PKC的表達較空白對照組明顯增高(P＜0.05)；當加入不同劑量的PGE_2時，能降低細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度，但與10ng/ml TNF-α組比較沒有統(tǒng)計學差異。PGE_2對PKC的表達顯示：隨著加入PGE_2劑量的增加，PKC水平有所上升，除與對照組比較有差異外，各劑量組之間沒有明顯的統(tǒng)計學差異。cAMP、cGMP的測定結(jié)果顯示：TNF-α聯(lián)合不同劑量的PGE_2與單獨10ng/ml TNF-α比較，在觀察時點4h時對cAMP表現(xiàn)降低效應，當作用時間延長到24h時，cAMP水平明顯升高，對cGMP的作用卻是隨著作用時間的延長而降低，因此表現(xiàn)cAMP/cGMP比值在作用時點24h時，隨PGE_2劑量增加而升高。成纖維細胞增殖試驗結(jié)果表明：cAMP水平較低而IP_3含量較高的10ng/mlTNF-α聯(lián)合1000pg/mlPGE_2組對成纖維細胞的增殖作用最強。結(jié)論：1．2000pg/m1PGE_2能明顯的增加成纖維細胞內(nèi)cAMP的水平，提高cAMP/cGMP的比值，從而能拮抗10ng/mlTNF-α對成纖維細胞的增殖效應，這一效應與作用時點有關(guān)系。2．成纖維細胞增殖與其細胞內(nèi)cAMP/cGMP比值和IP_3之間的濃度比例有密切關(guān)系。3．PGE_2的抑纖維化效應是由cAMP介導的。4．IP_3/Ca和DAG/PKC信號途徑表現(xiàn)互為拮抗。 第四部分OM抗石英對AM保護效應的研究 目的：探討OM抗石英對AM保護效應。材料與方法：應用支氣管肺灌洗方法。收集Wistar大鼠的AM，AM濃度為1*10~6/ml，進行純化培養(yǎng)并按實驗設(shè)計的要求進行刺激培養(yǎng)。實驗分為6組：即，100μg/ml石英組和100μg/ml石英聯(lián)合200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1 600μg/ml、3 200μg/ml的OM組，每紐設(shè)4瓶平行樣品。用小鼠胸腺細胞增殖法和雙抗夾心法分別測定AM培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α細胞因子的含量；2、4二硝基苯肼比色法測定AM內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)的活力；TBA比色法測定AM內(nèi)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量：結(jié)果：OM能抑制石英誘導AM分泌TNF-α和IL-1。在實驗設(shè)計的藥物劑量范圍內(nèi)，從200～1 600μg/ml，TNF-α的表達水平隨藥物劑量的增加而下降，存在藥物劑量依賴關(guān)系，當藥物達到3 200μg/ml時，藥效減弱；IL-1的表達水平也隨藥物劑量的增加而降低，尤其是從800～1 600μg/ml時有明顯下降。結(jié)論：OM具有抗氧化和保護巨噬細胞膜的功能。 第五部分OM抗TNF-α對成纖維細胞增殖機理研究 目的：探討OM抗TNF-α對成纖維細胞增殖機理。材料與方法：應用組織塊法原代培養(yǎng)3天大乳鼠肺成纖維細胞，細胞傳代到4-5代時用于實驗，按實驗設(shè)計的要求對成纖維細胞進行刺激培養(yǎng)，實驗分為5組：即：空白對照組，10ng/mlTNF-α組，200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml不同濃度的OM組。每組3個平行樣品。應用免疫組織化學方法測定成纖維細胞膜TNF-αR的表達和PKC的表達；放射免疫分析方法檢測成纖維細胞IP_3、cAMP和cGMP的水平；應用流氏細胞技術(shù)檢測纖維細胞內(nèi)Ca離子的含量；MTT法測定成纖維細胞的增殖水平。結(jié)果：OM能拮抗TNF-α與受體結(jié)合，且隨OM劑量增加，TNF-αR表達下降；同時使PKC、IP_3和Ca離子的表達結(jié)果也隨著OM的劑量增加而減弱。cAMP和cGMP的實驗結(jié)果顯示了隨OM濃度的升高，cAMP值和cAMP/cGMP比值逐漸升高，當OM濃度為800μg/ml時，cAMP值和cAMP/cGMP比值達到最高；但在不同濃度OM組間，cAMP值無統(tǒng)計學差異，不同劑量的OM組與10ng/mlTNF-α組和對照組間有明顯的統(tǒng)計學差異，P＜0.01。cGMP值隨著OM濃度的升高而降低。結(jié)論：1．OM能拮抗TNF-α對成纖維細胞膜TNF-αR表達，降低細胞內(nèi)PKC、IP_3和Ca離子水平，提高cAMP/cGMP比值。2．OM抑制成纖維細胞增殖機理是由cAMP介導的。
【圖文】：

與對照組比較;*:P<O.05，與石英組比較。2.2粗凋亡檢測結(jié)果:圖1顯示:通過TUNEL染色表明，石英作用 AM24h幾乎所有的AM全部凋亡，用抗TNF一Q抗體和OM提前1h處理細胞，可明顯的抑制石英誘導AM的凋亡。圖中的綠色熒光代表細胞凋亡數(shù)，紅色熒光代表其余全部細胞數(shù)。結(jié)果見圖1空白對照組100p刁ml石英組100林g/ml石英+long/ml抗圖1TNF一a抗體 100林g/ml石英+800林 g/mlOMTUNEL法檢測AM凋亡圖3.討論塵肺纖維化被認為是繼發(fā)于炎癥過程中的肺組織重建，脂質(zhì)過氧化、AM膜結(jié)構(gòu)破壞及分泌大量的細胞因子是啟動肺纖維化發(fā)生前的必然事件。TNF一Q是粉塵導致AM膜結(jié)構(gòu)破壞以后分泌的一種前炎性細胞因子}‘，’。已有大量的資料表明:TNF一。在塵肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用“3，“’。2003年 PryhuberGs研究發(fā)現(xiàn)

即笱Р┦墾絎宦畚乤NF一a誘導塵肺纖維化分子機理研究度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。TNF一a的劑量為10ng/ml時，Ca離子濃度達到最大，但通過多組均數(shù)間兩兩比較，不同TNF一Q劑量組之間沒有統(tǒng)計學意義。結(jié)果見圖7、8和表3�！卜嫦酒嚦悄若骐A娜屬叼鞠翩口口三月目...月通，圖7不同劑量TNF一a對成纖維細胞Ca離子的影響，流式細胞測定Ca離子疊加圖鋇叮定Ca離子樣圖圖8不同劑量TNF一a對成纖維細胞Ca離子的影響從左上依次為空自對照組、sng/ml、long/ml和Zong/ml組。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R135.2

【參考文獻】

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1 伍嚴安,高春芳,王皓,黃超,孔憲濤;苦參堿抑制血小板衍生生長因子誘導的小鼠皮膚成纖維細胞增殖[J];第二軍醫(yī)大學學報;2000年08期

2 張俊平，胡振林，林文，錢定華;苦參堿對巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子及其蛋白激酶C活性的影響[J];第二軍醫(yī)大學學報;1995年06期

3 甘樂文,王國俊,李玉莉;氧化苦參堿對大鼠肝纖維化的影響[J];第二軍醫(yī)大學學報;1999年07期

4 艾靜,高煥煥,王s

本文編號：2637057