【摘要】：芥子氣(sulfur mustard,SM),是糜爛性毒劑的代表,在第一次世界大戰(zhàn)中被首次使用,后又相繼在日本侵華戰(zhàn)爭、兩伊戰(zhàn)爭及敘利亞內(nèi)戰(zhàn)中被使用,造成大量人員中毒甚至死亡。芥子氣作用時間長,中毒途徑多,穿透性強,且尚無特效的防治措施,所以仍是我軍面臨的主要化學(xué)戰(zhàn)劑威脅之一。芥子氣是日本遺棄在華的主要化學(xué)戰(zhàn)劑之一,對我國人民的健康和環(huán)境安全構(gòu)成重大威脅,尤以東北地區(qū)最為嚴(yán)重。因此,積極探究芥子氣的中毒機制,尋找有效的防治藥物,對維持我軍戰(zhàn)斗力、保障公民健康及保護生態(tài)環(huán)境均有著重要的戰(zhàn)略意義。芥子氣可引起體內(nèi)多臟器的中毒損傷,其中肺是芥子氣損傷的主要靶器官。大量研究發(fā)現(xiàn),芥子氣中毒后可引起呼吸道的炎癥及肺泡結(jié)構(gòu)的破壞,從而引起急性肺損傷導(dǎo)致患者死亡。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是一類成體干細胞,具有自我更新以及分化的功能。研究表明BMSCs可以通過分泌抗炎性細胞因子、調(diào)節(jié)免疫細胞分型、分泌生長因子及分化作用等多種途徑對損傷組織的修復(fù)、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)產(chǎn)生作用,從而減輕肺部炎癥反應(yīng)、加速損傷肺組織的修復(fù),緩解肺損傷。本文研究發(fā)現(xiàn),BMSCs能通過分泌EGF、FGF、PDGF等生長因子,促進I型、II型肺泡上皮細胞增生,加強細胞連接等途徑對肺損傷的修復(fù)產(chǎn)生影響,從而減輕肺水腫,并對芥子氣中毒小鼠肺功能起到改善作用。此外BMSCs還可以通過影響巨噬細胞和T淋巴細胞的分化、調(diào)節(jié)TLR4信號通路的表達從而顯著降低促炎性細胞因子的表達,升高抗炎性細胞因子的表達。一、BMSCs的鑒定及其在芥子氣中毒小鼠體內(nèi)的定位取ICR小鼠股骨和脛骨進行BMSCs的原代分離及培養(yǎng),通過流式細胞術(shù)檢測表面標(biāo)志抗原及干細胞誘導(dǎo)分化實驗對所獲得的BMSCs進行鑒定:結(jié)果顯示分離培養(yǎng)獲得的細胞可以高表達間質(zhì)類細胞特異性表面抗原CD73、CD90、CD105,不表達或低表達造血細胞表面抗原CD11b、CD19。透過誘導(dǎo)分化實驗發(fā)現(xiàn),獲得的BMSCs能成功地分化為成脂細胞、成骨細胞及成軟骨細胞。本研究通過將ICR小鼠皮下注射芥子氣的方法建立了芥子氣染毒的動物模型,將培養(yǎng)擴增鑒定后的BMSCs通過尾靜脈注射從而進行下一步實驗研究。首先我們通過小動物活體成像的方法明確了BMSCs在芥子氣染毒小鼠模型中的定位,發(fā)現(xiàn)其主要聚集于雙側(cè)肺臟,其中1h和2h熒光強度明顯升高,至24h仍有一定的熒光信號,明確了BMSCs可以作用于芥子氣損傷后的主要靶器官-肺臟。二、BMSCs對芥子氣中毒小鼠肺損傷修復(fù)的作用及機制研究本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),BMSCs治療能顯著降低芥子氣中毒小鼠肺濕/干重比和肺泡灌洗液中總蛋白濃度。為進一步觀察損傷修復(fù)在BMSCs治療芥子氣肺損傷中的作用,我們通過ELISA法檢測了肺組織內(nèi)生長因子的變化,結(jié)果顯示BMSCs治療后可以顯著提高芥子氣中毒小鼠肺組織內(nèi)EGF、FGF、PDGF的表達。Ki-67染色結(jié)果顯示,BMSCs治療后小鼠肺組織內(nèi)Ki-67陽性細胞比例與芥子氣組相比顯著升高。此外,我們還發(fā)現(xiàn)芥子氣損傷后,肺組織內(nèi)I型、II型肺泡上皮細胞表面標(biāo)志蛋白AQP5、SP-C及細胞連接蛋白VE-cadherin、Occludin、Claudin-5、ZO-1、Caveolin-1均不同程度降低,而BMSCs治療后AQP5、SP-C、VE-cadherin、Occludin、Claudin-5、ZO-1、Caveolin-1的表達均顯著提高。以上結(jié)果提示,BMSCs能通過分泌生長因子、促進受損的肺泡上皮細胞增殖、促進上皮細胞連接的修復(fù)及分化成為肺泡上皮細胞等多種途徑促進受損肺上皮的修復(fù),從而減輕肺水腫、改善肺功能。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)BMSCs能顯著改善芥子氣中毒小鼠生存率的變化,本研究中我們進一步檢測了BMSCs對于芥子氣中毒小鼠肺功能的影響。結(jié)果表明,芥子氣中毒后,小鼠最大呼氣流速、最大吸氣流速、每分鐘通氣量以及50%肺容積呼氣流速與正常組相比明顯降低,給予BMSCs治療后上述指標(biāo)出現(xiàn)升高,提示BMSCs治療能在一定程度上改善芥子氣中毒小鼠的肺功能。三、BMSCs對芥子氣中毒小鼠免疫調(diào)節(jié)的作用及機制研究本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),BMSCs能通過減少趨化因子的產(chǎn)生從而顯著降低芥子氣中毒小鼠肺組織內(nèi)巨噬細胞、T淋巴細胞等炎細胞的浸潤,因此本研究進一步考察了其對于巨噬細胞及T淋巴細胞分型的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與芥子氣組相比較,BMSCs可以顯著降低促炎性M1型巨噬細胞及Th17細胞的表達,升高抗炎性M2型巨噬細胞及Treg細胞的表達。提示BMSCs能通過調(diào)節(jié)免疫細胞的分型從而減輕芥子氣所致肺損傷。為進一步考察免疫調(diào)節(jié)在BMSCs治療芥子氣肺損傷中的作用,我們檢測了小鼠肺組織及細胞模型中TNF-?、IL-1?、IL-6、IL-12、IL-17等促炎因子及IL-10、TGF-?等抗炎因子的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與芥子氣組比較,BMSCs可以顯著降低肺組織中TNF-?、IL-1?、IL-6、IL-12、IL-17的表達量,升高IL-10、TGF-?的表達量。在芥子氣染毒的小鼠巨噬細胞(Raw 264.7)及脾淋巴細胞模型中,將其與BMSCs共培養(yǎng)后同樣可以顯著降低培養(yǎng)上清液中TNF-?、IL-1?、IL-12、IL-17的表達量,升高IL-10、TGF-?的表達量。提示BMSCs能通過降低促炎因子、升高抗炎因子減輕體內(nèi)炎癥反應(yīng)。我們進一步在動物及細胞水平上探究了可能在BMSCs減輕芥子氣損傷中發(fā)揮作用的信號通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組相比較,芥子氣染毒后小鼠肺組織內(nèi)TLR4及其及其下游NF-κB p65、p50的表達量明顯增高,給予BMSCs治療可明顯降低TLR4、NF-κB p65、p50的表達。在Raw264.7細胞模型中,TLR4、NF-κB p65、p50的表達量同樣出現(xiàn)升高,給予BMSCs Transwell共培養(yǎng)、敲除巨噬細胞內(nèi)TLR4受體或給予TLR4抑制劑TAK242后,TLR4、NF-κB p65、p50的表達量均顯著降低。提示TLR4信號通路可能在BMSCs調(diào)節(jié)芥子氣肺損傷的過程中發(fā)揮著重要作用。
【圖文】：

軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文三、實驗結(jié)果（一）ICR 小鼠 BMSCs 的鑒定1、ICR 小鼠 BMSCs 表面標(biāo)志物的流式鑒定結(jié)果BMSCs 是一類異質(zhì)性細胞。無特異性的表面標(biāo)記分子，主要通過多種表面物的標(biāo)記來檢測和純化。流式檢測結(jié)果顯示，第3代ICR小鼠BMSCs高表達CDD90、CD105，陽性率分別為 96.49%、98.55%、96.53%；而幾乎不表達 CD1D19，陽性率分別為 0.73%、0.19%（圖 1）。

骨髓間充質(zhì)干細胞在治療芥子氣肺損傷中的損傷修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)作用研究（2）BMSCs 的成骨誘導(dǎo)取 P3 代 BMSCs 進行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 21d 后，倒置顯微鏡下可見 BMSCs 變?yōu)椴灰?guī)則的多角形，細胞間質(zhì)內(nèi)可見大量鈣化結(jié)節(jié)。茜素紅染色后呈現(xiàn)紅色（圖 2-B）。（3）BMSCs 的成軟骨誘導(dǎo)取 P3 代 BMSCs 進行成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 21d 后，，倒置顯微鏡下可見 BMSCs 細胞內(nèi)基質(zhì)糖胺聚糖。甲苯胺藍染色后為藍色（圖 2-C）。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R563

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