【摘要】： 目的:建立一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)檢測和鑒定常見下呼吸道感染病原菌的方法,以提高臨床檢測病原菌的速度及準(zhǔn)確性。證實(shí)其在診斷上的應(yīng)用價(jià)值。 方法:1.確定常見下呼吸道感染11種病原菌:肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎支原體、肺炎衣原體;2.通過BLAST、Align X和Primer 5.0程序,對各病原菌菌株的基因保守區(qū)進(jìn)行序列分析,設(shè)計(jì)并合成本試驗(yàn)所需的引物;3.收集我院診斷為下呼吸道感染的50例患者痰標(biāo)本;3.提取各標(biāo)本中病原體DNA;4.將提取的DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增,放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-Time PCR)儀65℃反應(yīng)45分鐘,行熒光方法檢測,測定熔解曲線,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;5.對檢測體系的靈敏度和特異性進(jìn)行測試;6.利用該檢測方法對50例臨床診斷為下呼吸道感染的痰標(biāo)本進(jìn)行LAMP法檢測,與傳統(tǒng)的痰常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行比較分析。 結(jié)果:1.病原菌的檢測靈敏度均可以達(dá)到200copies/25ul反應(yīng)體系(相當(dāng)于1.7×104copies/ml痰液);2.每種菌株的引物只與其相應(yīng)的細(xì)菌DNA反應(yīng),而與下呼吸道感染常見11種病原菌無交叉反應(yīng),表明探針具有較高的特異性;3.LAMP檢測的陽性率為82.0%,較常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)的陽性率高;4.LAMP技術(shù)能檢測出多數(shù)濃度較低的樣品細(xì)菌或者難培養(yǎng)的細(xì)菌。 結(jié)論:本研究初步建立的下呼吸道感染病原菌LAMP技術(shù)能夠準(zhǔn)確、敏感、快速、高效地檢測痰標(biāo)本中的病原菌,為進(jìn)一步完善和建立下呼吸道感染病原菌的LAMP基因芯片檢測技術(shù)打下了基礎(chǔ)。
【圖文】：

序列和F2(F2c區(qū)域的互補(bǔ)序列)，即5'-F1c-F2；內(nèi)引物BIP(backward innerprimer) 包含B1c(B1區(qū)域的互補(bǔ)序列)和B2序列，即5'-B1c-B2。外引物為F3和B3序列。如圖1所示：圖1 靶序列上6個(gè)特異區(qū)域及引物設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)過程包括啞鈴狀模板合成階段、循環(huán)擴(kuò)增階段、伸長和再循環(huán)階段[5]。利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件(65℃左右)保溫約60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增出LAMP特征性梯狀條帶。還可通過設(shè)計(jì)兩條環(huán)引物（FL、BL）可使反應(yīng)速度提升1/2-1/3[6]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)果判定主要方法有: (1)電泳。將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在紫外燈下觀察可見擴(kuò)增產(chǎn)物呈梯狀條帶；(2)直接觀察擴(kuò)增管的濁度。研究發(fā)現(xiàn)LAMP陽性擴(kuò)增管反應(yīng)后形成副產(chǎn)品焦磷酸鎂, 而沒有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的陰性管中沒有副產(chǎn)品焦磷酸鎂產(chǎn)生，，因此陽性管的濁度比陰性管高，經(jīng)高速離心后出現(xiàn)更為明顯的白色沉淀，陰性對照管則沒有白色沉淀[7]；(3)加入染料直接用肉眼判定結(jié)果。可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料SYBR Green I染色，在紫外燈或日光下通過肉眼進(jìn)行判定，如果含有擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)混合物變綠；反之,則保持SYBR Green I的橙色不變[8]。隨著LAMP方法的不斷發(fā)展，目前電泳法已經(jīng)很少應(yīng)用。LAMP反應(yīng)體系的構(gòu)成和PCR的相似，包含了引物、模板DNA、Bst DNA聚合酶、dNTP和緩沖液。其操作程序簡便

4copies/ml痰液）。以肺炎鏈球菌為例，如圖2：45分鐘內(nèi)靈敏度可以達(dá)到2E+02copies/25μl；空白對照BC及1號(hào)管在45分鐘內(nèi)無假陽性擴(kuò)增。3.2 LAMP技術(shù)的特異性所檢測的某一病原菌的特異性與11種下呼吸道感染病原菌及常見的11種病原菌無交叉反應(yīng)，以肺炎鏈球菌為例，如圖3：
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R56;R450

【引證文獻(xiàn)】

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1 陳愉生;王大璇;陳p営

本文編號(hào)：2634841