【摘要】： 氣道是連接咽和肺之間的呼氣和吸氣的通道,主要由氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肥大細(xì)胞等組成。氣道的有節(jié)律性的收縮,可以保證呼吸作用的正常進(jìn)行。當(dāng)哮喘發(fā)生時,會使氣道壁頻繁痙攣,呼吸困難。哮喘的反復(fù)發(fā)作會引起氣道壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化:氣道平滑肌增殖和變厚、細(xì)胞外基質(zhì)沉淀等,導(dǎo)致氣流阻塞以及非特異性的氣道高反應(yīng)性[1-2]。 哮喘病現(xiàn)在仍然是一個亟待解決的世界性難題,目前我們對哮喘病的發(fā)病機(jī)理還存在著爭議,還需要我們做更多的基礎(chǔ)性研究來更深層次的了解哮喘病。在本課題研究中,我們基于哮喘病患者的氣道平滑肌增厚和收縮能力下降這些癥狀,模擬身體內(nèi)的力學(xué)環(huán)境,研究正常的氣道平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞在受到外來壓力刺激的時候,是否這些正常的平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)特性會發(fā)生改變。 上皮細(xì)胞位于氣道的最外層,在它的下面是平滑肌細(xì)胞。當(dāng)上皮細(xì)胞受到刺激后,可以分泌一些細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子擴(kuò)散到平滑肌細(xì)胞上面以后,會引起平滑肌細(xì)胞的某些生物學(xué)特性的改變。我們的主要工作就是設(shè)計一個細(xì)胞共培養(yǎng)模型,把上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)在一起,然后對這個系統(tǒng)施加壓力,最后檢測平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)特性是否改變。主要研究工作和結(jié)果如下: ①大鼠氣道平滑肌細(xì)胞(SMC)、上皮細(xì)胞(RTE)的原代培養(yǎng)和鑒定 利用組織貼塊法對大鼠氣道平滑肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),利用胰蛋白酶消化法對上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。經(jīng)過摸索,組織貼塊法能夠獲得純度很高的平滑肌細(xì)胞。在無菌環(huán)境下解剖大鼠,將獲得的氣管剪成小塊,平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)六天左右,可見有細(xì)胞爬出來,呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞特有的外觀。同樣,利用氣管灌注法,0.05%的胰蛋白酶能夠消化得到很多上皮細(xì)胞,經(jīng)過一些純化處理以后,即可以得到純度較高的上皮細(xì)胞。等到兩種細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部80%左右時,即可以用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。 將兩種細(xì)胞進(jìn)行鑒定。首先,在形態(tài)學(xué)上,兩種細(xì)胞的符合各自的標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)。然后對平滑肌細(xì)胞特異的α-肌動蛋白進(jìn)行免疫熒光染色,得出結(jié)論所獲得的確實是平滑肌細(xì)胞。再根據(jù)上皮細(xì)胞特征性地表達(dá)角蛋白,利用細(xì)胞免疫組化(SABC)法,可以判定成功獲得上皮細(xì)胞。 ②受力情況下與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的氣道平滑肌的增殖 本課題中,利用MTT法,對四種不同培養(yǎng)情況下的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行增殖測定,最后繪制出不同培養(yǎng)條件下的氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)的生長曲線。結(jié)果顯示:與上皮細(xì)胞共培養(yǎng),并且受到壓力刺激的情況下,平滑肌細(xì)胞增殖速度要比其他培養(yǎng)條件要更快一些。并且通過對比分析,說明在壓力條件下,上皮細(xì)胞會分泌一些細(xì)胞因子,這些因子與平滑肌細(xì)胞結(jié)合,促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖。 ③受力情況下與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的氣道平滑肌的剛度 本課題中,利用原子力顯微鏡(AFM),對四種不同培養(yǎng)情況下的平滑肌細(xì)胞的楊氏模量(即剛度)進(jìn)行測定,通過比較,得到下面結(jié)果:和其他幾種培養(yǎng)條件相比,與上皮細(xì)胞共培養(yǎng),并且受到壓力刺激的情況下,平滑肌細(xì)胞的剛度要明顯變大。這可以說明,通過共培養(yǎng)系統(tǒng)模擬氣道,對其施加壓力,平滑肌細(xì)胞的剛度會變大,這也許和哮喘患者的氣道潛在收縮能力變強(qiáng)。 所有本課題研究的結(jié)果表明,在施加壓力條件下,平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)很好的模擬了哮喘患者的氣道環(huán)境,出現(xiàn)了平滑肌細(xì)胞增殖、剛度變大的現(xiàn)象。這樣,在以后的研究中,科研人員可以利用這個共培養(yǎng)模型,通過分析這個過程中的培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子,來證明在受到壓力刺激情況下,上皮細(xì)胞究竟是通過哪種細(xì)胞因子來影響平滑肌細(xì)胞的生物特性。
【圖文】：

圖2.1 平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)Fig.2.1 The ASMCs in primary culture.圖2.2 第二代培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞Fig.2.2 The second generation of cultured ASMCs.

10圖2.1 平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)Fig.2.1 The ASMCs in primary culture.圖2.2 第二代培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞Fig.2.2 The second generation of cultured ASMCs
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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