【摘要】： 水通道蛋白5敲除對呼吸道粘液表達(dá)譜的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究 第一部分 水通道蛋白5在慢性哮喘小鼠模型氣道炎癥和粘液分泌中的作用 目的氣道粘液高分泌是慢性氣道疾病的特征,水通道蛋白5對于呼吸道液體分泌的量起著很重要的作用,本研究從動物水平探討在屋塵螨致敏的慢性哮喘小鼠模型中,水通道蛋白5基因敲除對氣道炎癥和粘液分泌的影響。 方法應(yīng)用水通道蛋白5基因敲除小鼠和野生型小鼠,屋塵螨滴鼻致敏制備慢性哮喘小鼠模型,HE檢測病理、炎癥評分,AB-PAS染色檢測小鼠氣道杯狀細(xì)胞的增生、免疫組化和Realtime-PCR檢測小鼠氣道粘蛋白MUC5AC、MUC5B的表達(dá)及定量,ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和MUC5AC的表達(dá)。 結(jié)果屋塵螨慢性滴鼻致敏后,和野生型小鼠相比,水通道蛋白5基因敲除鼠病理評分減輕,BALF中Th2細(xì)胞因子減少,Thl細(xì)胞因子增加,BALF液中MUC5AC蛋白、肺組織中MUC5AC、MUC5B基因和蛋白表達(dá)減少。 結(jié)論水通道蛋白5基因敲除慢性哮喘小鼠過敏性炎癥和氣道粘液分泌較野生型小鼠減輕。 第二部分 水通道蛋白5對PMA誘導(dǎo)的原代小鼠氣道上皮細(xì)胞MUC5AC合成的影響 目的氣道上皮是呼吸道和外環(huán)境相互作用的非特異性屏障,原代培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞保留在體上皮細(xì)胞的特征和功能,是研究呼吸道上皮細(xì)胞很好的模型。本研究從細(xì)胞水平,探討AQP5對PMA誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)小鼠氣道上皮細(xì)胞MUC5AC合成的影響及可能機(jī)制。 方法原代培養(yǎng)兩種小鼠(水通道蛋白5基因敲除鼠和野生鼠)氣道上皮細(xì)胞,transwell建立氣液平面,2周后掃描電鏡及角蛋白免疫組化鑒定氣道上皮細(xì)胞。PKC特異性激動劑PMA刺激原代小鼠氣道上皮細(xì)胞及PKC通路特異性阻斷劑Calphostinc阻斷該通路,ELISA檢測兩組小鼠MUC5AC蛋白水平的變化,用western blotting檢測兩組小鼠氣道上皮細(xì)胞PMA刺激后PKC、p-PKC、p-p38、p38、ERK、p-ERK的表達(dá)差異。 結(jié)果氣液平面培養(yǎng)后,掃描電鏡顯示培養(yǎng)的細(xì)胞上皮有微絨毛和纖毛覆蓋,細(xì)胞角蛋白14免疫組化染色為陽性。PMA 20ng/ml刺激24小時(shí)后,兩組小鼠氣道上皮細(xì)胞分泌的MUC5AC明顯升高,水通道蛋白5基因敲除鼠增加更顯著,兩者有顯著性差異。PKC特異性阻斷劑Calphostinc能阻斷PMA引起的兩組小鼠MUC5AC分泌。原代小鼠氣道上皮細(xì)胞經(jīng)PMA刺激后,western blotting檢測顯示PKC、p38磷酸化激活,ERK通路無變化。 結(jié)論AQP5通過Ca2+-PKC-p38信號通路影響粘蛋白MUC5AC的合成和分泌。 第三部分 LPS誘導(dǎo)的粘液下腺細(xì)胞MUC5AC和AQP5的變化和調(diào)控機(jī)制 目的氣道粘液分泌物由水和粘蛋白MUC5AC等組成,水／粘蛋白的比例失調(diào)導(dǎo)致痰液粘稠,影響纖毛清除功能。本研究從細(xì)胞水平探討在LPS刺激粘液下腺SPC-A1細(xì)胞后,MUC5AC和AQP5的變化和調(diào)控機(jī)制。 方法用LPS刺激SPC-A1細(xì)胞,Realtime-PCR檢測AQP5和MUC5AC mRNA水平的變化,western blotting、ELISA法檢測AQP5和MUC5AC蛋白的變化。用EGFR抑制劑AG1478及MAPKs抑制劑(ERK抑制劑PD98059、p38 MAPK抑制劑ML3404、JNK抑制劑SP600125)干預(yù),LPS刺激SPC-A1細(xì)胞6小時(shí)后Realtime-PCR檢測AQP5和MUC5ACmRNA的表達(dá)。 結(jié)果LPS刺激SPC-A1細(xì)胞后,MUC5AC基因和蛋白水平呈時(shí)間、濃度依賴性升高,同時(shí)AQP5基因和蛋白水平呈時(shí)間、濃度依賴性降低,兩者呈負(fù)相關(guān)。EGFR抑制劑、p38/JNK抑制劑顯著降低LPS誘導(dǎo)的MUC5ACmRNA的升高,p38/JNK抑制劑減輕AQP5mRNA的降低。 結(jié)論P(yáng)38/JNK抑制劑為AQP5和MUC5AC共同的信號通路,應(yīng)用P38/JNK抑制劑能同時(shí)減輕LPS誘導(dǎo)MUC5AC和AQP5的變化,改善水／粘液比例。
【圖文】：

結(jié)果一AQPS基因敲除鼠的鑒定鼠尾PCR產(chǎn)物出現(xiàn)450飾條帶為AQPS基因敲除鼠，野生型小鼠無此條帶;出現(xiàn)270bP條帶為野生型小鼠，AQPS基因敲除鼠無此條帶(如圖IA)。AQPS免疫組化檢測顯示野生型小鼠氣道和肺泡I型細(xì)胞膜頂部可見棕褐色陽性染色(圖IB一l)，而AQPS基因敲除鼠肺臟未見有陽性染色(圖IB一2)。

三.小鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子的變化EUSA檢測各組小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞因子，相比對照組，哮喘組小鼠細(xì)胞因子BALF中IL一。和IL一4含量分別為4012土303.13pg/ml和156.3士9.3lp留ml，較對照組明顯增高(P<0.05)，IL一2、IFN一Y含量分別為18.1巧.3p留ml和82.4士7.2p創(chuàng)ml，較對照組下調(diào)(P<0.05);AQPS基因敲除鼠哮喘組IL一10和IL一4含量分別為3542.1士436.3pg/ml和108土8.1pg/ml，與野生鼠哮喘組相比有明顯減低(P<0.05)，IL一2、IFN一丫升高含量分別為90.1士9.3pg/ml和121.2士11.6p留ml，較野生鼠哮喘組上升(P<0.05)，兩組小鼠對照組無明顯差異(圖3)。肺泡灌洗液細(xì)胞因子檢測提示AQPS基因敲除可減輕屋塵瞞致敏小鼠肺部變態(tài)反應(yīng)性炎癥改變。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 白春學(xué)，吳淦桐，洪群英，徐昕紅，褚云鴻，鈕善福;1，6－二磷酸果糖對抗原誘發(fā)致敏豚鼠氣管條和肺條收縮的舒張作用[J];上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1996年03期

2 ;Decreased expression of human aquaporin-5 correlated with mucus overproduction in airways of chronic obstructive pulmonary disease[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年08期

3 毛翎,白春學(xué),張敏,王悅虹,陳杰;表皮生長因子受體和黏蛋白在慢性阻塞性肺疾病氣道中的表達(dá)及意義[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2004年09期

4 焦光宇,李爾然,于潤江;內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠呼吸膜AQP1及AQP5表達(dá)的研究(英文)[J];Chinese Medical Journal;2002年07期

5 ;Increased expression of human calcium-activated chloride channel 1 is correlated with mucus overproduction in the airways of Chinese patients with chronic obstructive pulmonary disease[J];Chinese Medical Journal;2007年12期

，

本文編號：2627704