【摘要】： 革蘭陰性菌外膜的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是引起全身炎性反 應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）、急性肺損傷 （acute lung injury, ALI）和急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distress syndrome, ARDS）的重要原因，而脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein, LBP）對LPS的致病性具有重要的調(diào)節(jié)作用。LPS侵入機(jī) 體后，首先在LBP介導(dǎo)下，與單核巨噬細(xì)胞膜上的LPS受體結(jié)合，由膜 受體將LPS信號傳入細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞質(zhì)中，組成信號通路的一系列蛋白 激酶被依次磷酸化，最終激活轉(zhuǎn)錄因子，并由轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)細(xì)胞因子和炎 性介質(zhì)的基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致一系列病理過程。有關(guān)LBP對LPS調(diào)節(jié)作 用的早期研究顯示：LBP可加速LPS與受體CD14的結(jié)合而增敏LPS對 靶細(xì)胞的作用。但最近有人觀察到：LBP還可促進(jìn)LPS與高密度脂蛋白 或巨噬細(xì)胞膜上清除受體（scavenger receptor, SR）的結(jié)合而加速LPS的 清除，從而減輕LPS的毒性作用。目前就LBP對LPS不同調(diào)節(jié)作用的機(jī) 制仍不清楚。 本研究圍繞LBP對LPS的調(diào)節(jié)作用，從以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究： 第一，經(jīng)50％飽和硫酸銨溶液鹽析、Bio-Rex70陽離子交換層析和MonoQ 陰離子交換層析，從大鼠急性反應(yīng)期血清中分離、純化LBP，為進(jìn)一步 研究LBP對LPS的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。第二，采用RT-PCR和Western- blotting，觀察LPS在誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA 表達(dá)及p38MAPK蛋白激酶活化的過程中，LBP對LPS調(diào)節(jié)作用的時(shí)間 和劑量依賴性，從細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄水平探討LBP對LPS的調(diào) 節(jié)機(jī)制。第三，用油酸和LPS復(fù)制一次打擊和二次打擊的大鼠急性肺損 傷模型，觀察LBPmRNA的動(dòng)態(tài)變化及山度若堿的保護(hù)作用，探討LBP 在體內(nèi)對LPS的增敏效應(yīng)及山莫蓉堿的保護(hù)機(jī)制。 研究結(jié)果顯示：①從300ml大鼠急性反應(yīng)期血清中分離、純化到762 u g大鼠 LBP，純化倍數(shù)達(dá) 1570倍。純化的大鼠 LBP在 SDS－PAGE的 60kD 處呈單一條帶，，并可明顯增強(qiáng) FITC毛PS與外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC） 的結(jié)合。②當(dāng) LPS為 0刀 ling幾，LBR為 ling／L以下時(shí)，各細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá)隨 LBP濃度的增加而增高，而 10mg／L LBP對各細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)的上調(diào)作用反而有所減弱；當(dāng) LPS濃度為 ling幾時(shí)，不同濃度的 LBP 對LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)無影響。＠在各時(shí)相 點(diǎn)，LBP對 0乃ling／L的 LPS均有明顯的調(diào)節(jié)作用，而對 ling／L 的 LPS 無調(diào)節(jié)作用。④LPS刺激15min后，p38MAPK的磷酸化活性開始增高， 30min達(dá)峰值，60min后下降。LPS濃度為 0．cling／L時(shí)，LBP對 LPS激 活 P38MAPK信號通路有明顯的增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用；LPS濃度為 ling／L時(shí)， LBP對LPS激活p38 MAPK無調(diào)節(jié)作用。⑤用油酸實(shí)施一次打擊，可使 肺組織中LBP的表達(dá)明顯增高。在此基礎(chǔ)上予小劑量LPS進(jìn)行二次打擊 后，肺組織中 TNF＊和 ILJ 0的表達(dá)增高；山度若堿干預(yù)可抑制 LBP的 上調(diào)，減少 TNF·口和 IL刁 0的表達(dá)，病理改變也明顯減輕。 以上結(jié)果表明：①用50％飽和硫酸鉸沉淀、Bio．Rex70陽離子交換層 析和MonoQ預(yù)裝柱的陰離子交換層析，可從大鼠急性反應(yīng)期血清中純化 到具有生物學(xué)活性的LBP。②LBP對LPS的調(diào)節(jié)作用具有明顯的劑量依 賴性，無時(shí)間依賴性。＠LBP可影響 LPS對 p38 MAPK信號通路的激活， 這是LBP對LPS發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的一個(gè)重要機(jī)制。④一次打擊后LBP的 反應(yīng)性上調(diào)是機(jī)體對二次打擊敏感性增加的重要原因。山度著堿可通過抑 制LBP的過度表達(dá)，阻斷LBP對LPS的增敏作用，從而發(fā)揮其對內(nèi)毒素 性肺損傷的防治作用。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2621423