【摘要】：研究目的良性氣道狹窄是一種威脅生命的呼吸系統(tǒng)疾病。近年來,隨著危重癥醫(yī)學(xué)和呼吸支持技術(shù)水平的提高,以及肺移植等手術(shù)的開展和普及,良性氣道狹窄的發(fā)生率逐漸增高。當(dāng)前,良性氣道狹窄的治療手段及療效均有限,治療主要包括:手術(shù)切除狹窄段及斷端吻合、球囊擴(kuò)張、冷凍治療、熱消融(YAG或CO_2激光、電凝、氬氣刀)治療、支架置入及局部/系統(tǒng)應(yīng)用類固醇。以手術(shù)治療為金標(biāo)準(zhǔn),但受狹窄段長(zhǎng)度及患者心肺基礎(chǔ)情況的限制,并不適用于所有患者;介入治療的再狹窄率高且需要定期氣管鏡隨訪。良性狹窄的主要發(fā)病機(jī)制是氣道粘膜損傷和由成纖維細(xì)胞主導(dǎo)的異常修復(fù)~([1,2])。該疾病通常始于(感染或非感染因素導(dǎo)致的)氣道粘膜大面積損傷,可伴隨局部出血或血管淤血、伴不同程度的炎癥反應(yīng)(炎癥細(xì)胞募集和炎癥介質(zhì)釋放),氣道粘膜繼而出現(xiàn)水腫、壞死、脫落、潰瘍,可合并病原體感染。然后,成纖維細(xì)胞大量募集和增殖,炎性細(xì)胞趨化及浸潤(rùn),新生毛細(xì)血管血管形成,共同構(gòu)成新鮮的肉芽組織。最后階段是氣道重塑,成纖維細(xì)胞分泌大量膠原纖維,造成膠原沉積,肉芽組織老化脫水,成纖維細(xì)胞變成具有收縮表現(xiàn)的肌成纖維細(xì)胞,發(fā)生組織攣縮及瘢痕狹窄。成纖維細(xì)胞的主要來源:鄰近纖維結(jié)締組織中的成纖維細(xì)胞遷移、上皮間質(zhì)化(EMT)及外周血循環(huán)纖維細(xì)胞等。我們作出大膽猜想:如若從病變?cè)缙诩匆胫委熓侄?促進(jìn)粘膜修復(fù)和減輕炎癥,是否可以從根源上緩解或避免肉芽組織過度增生。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)兼具促進(jìn)組織修復(fù)及抗炎功能,是治療的絕佳選擇。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是成體干細(xì)胞的一種,來源于發(fā)育早期中胚層,具有高度自我更新、多向分化潛能。MSCs治療疾病有多種機(jī)制:分化代替、旁分泌、外泌體及線粒體轉(zhuǎn)移。骨髓是MSCs的重要來源之一,本課題組在骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)研究相關(guān)領(lǐng)域積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。為了研究BMMSCs在良性氣管狹窄治療中的潛力,我們建立了尼龍刷刮擦良性氣管狹窄的SD大鼠模型,應(yīng)用BMMSCs作為局部治療,并對(duì)治療前景和機(jī)制進(jìn)行初步探索。研究方法首先我們采用全骨髓貼壁法進(jìn)行SD大鼠BMMSCs的原代培養(yǎng),通過流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)BMMSCs進(jìn)行表型鑒定,并進(jìn)行(成骨、成脂)誘導(dǎo)分化鑒定。采用鏈蛋白酶冷消化法進(jìn)行SD大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞(TBECs)的原代培養(yǎng),并進(jìn)行純度鑒定。細(xì)胞鑒定后,通過Transwell小室構(gòu)建SD大鼠BMMSCs與TBECs共培養(yǎng)體系,體外劃痕實(shí)驗(yàn)探索BMMSCs對(duì)上皮修復(fù)的作用。用人來源BMMSCs與正常人來源支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)重復(fù)上述共培養(yǎng)-劃痕實(shí)驗(yàn)。其次,我們以220g-300g體重的雄性Sprague Dawley大鼠為研究對(duì)象,通過尼龍刷刮擦機(jī)械性損傷氣道粘膜的方式,建立良性氣管狹窄的SD大鼠模型,觀察造模后大鼠的癥狀體征及生存情況。并通過HE染色及Masson染色,探索造模后不同時(shí)間點(diǎn)氣管組織的病理變化。而后在粘膜機(jī)械損傷的局部應(yīng)用1×10~6BMMSCs,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索BMMSCs對(duì)良性氣道狹窄治療的可行性。將SD大鼠分為3組:偽手術(shù)組、狹窄模型組(尼龍刷刮擦機(jī)械損傷)和BMMSCs治療組(尼龍刷刮擦機(jī)械損傷+BMMSCs局部治療),自然死亡的動(dòng)物即時(shí)收集樣本,其余存活動(dòng)物于造模后第22天統(tǒng)一處死。收集氣管組織,固定于4%磷酸鹽緩沖的多聚甲醛,HE染色后觀察病理改變,并分析評(píng)估管腔大小、測(cè)算狹窄指數(shù)。另取SD大鼠重復(fù)造模及BMMSCs治療,通過HE染色與PAS染色探索造模+BMMSCs局部治療后不同時(shí)間點(diǎn)上皮組織的修復(fù)情況。最后部分探索了BMMSCs促進(jìn)上皮修復(fù)及預(yù)防肉芽組織增生的機(jī)制。我們通過CFSE熒光染料標(biāo)記BMMSCs,機(jī)械損傷及BMMSCs ~(CFSE)治療4天后對(duì)氣管組織進(jìn)行冰凍切片、泛角蛋白免疫熒光染色,觀察BMMSCs是否能夠通過直接分化替代的方式來修復(fù)上皮結(jié)構(gòu)。另取SD大鼠分為3組:偽手術(shù)組、狹窄模型組(尼龍刷刮擦機(jī)械損傷)和BMMSCs治療組(尼龍刷刮擦機(jī)械損傷+BMMSCs局部治療),第四天處死并收集新鮮外周血及氣管組織。氣管組織進(jìn)行RNA提取,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢查各細(xì)胞因子表達(dá)水平。由于肉芽組織主要成分為成纖維細(xì)胞,而循環(huán)纖維細(xì)胞為成纖維細(xì)胞主要來源之一,本研究還應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)對(duì)不同組外周血循環(huán)纖維細(xì)胞百分比進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果一、大鼠來源細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:劃痕后以DMEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),對(duì)照組上皮細(xì)胞平均遷移速度為(19.82±5.43)μm/hr,BMMSCs共培養(yǎng)組為(59.42±2.976)μm/hr,p=0.0002,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。人來源細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:DMEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),單純劃痕組經(jīng)過16h培養(yǎng)后,劃痕愈合速度為(37.91±2.79)μm/hr,MSCs共培養(yǎng)組劃痕愈合速度為(67.60±8.51)μm/hr,p0.0001;大氣道上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基重復(fù)劃痕實(shí)驗(yàn),對(duì)照組上皮細(xì)胞平均遷移速度為(83.92±4.91)μm/hr,BMMSCs共培養(yǎng)組為(124.2±5.55)μm/hr,p0.0001。共培養(yǎng)體系-劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMMSCs可加速上皮細(xì)胞遷移及修復(fù)。二、成功建立尼龍刷刮擦良性氣管狹窄的SD大鼠模型,尼龍刷機(jī)械刮擦可嚴(yán)重?fù)p傷氣道上皮、引起肉芽組織顯著增生及氣管狹窄。造模第8天,大鼠生存率為0,氣管幾乎完全被新生肉芽組織閉塞,而對(duì)照組無死亡事件。造模后d2、4、6、8天的氣管組織呈不同期病理改變,與文獻(xiàn)報(bào)道的組織損傷修復(fù)過程相仿。三、偽手術(shù)組狹窄指數(shù)為(5.55±2.71)%,狹窄模型組為(55.87±8.76)%,BMMSCs治療組為(11.12±4.80)%,偽手術(shù)組與機(jī)械損傷組間狹窄度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.0001;偽手術(shù)組與BMMSCs治療組間狹窄度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;機(jī)械損傷組與BMMSCs治療組間狹窄度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.0001。21天存活率偽手術(shù)組100%,機(jī)械損傷組0%,BMMSCs治療組80%。BMMSCs局部應(yīng)用可促進(jìn)損傷后的上皮修復(fù),改善肉芽形成從而減輕氣道阻塞,大大降低狹窄指數(shù),提高存活率。四、BMMSCS(CFSE綠色熒光標(biāo)記)與修復(fù)后的上皮(泛角蛋白染色紅色熒光)信號(hào)不重合,提示BMMSCs促進(jìn)上皮修復(fù)并非通過直接分化替代的方式。偽手術(shù)組大鼠外周血循環(huán)纖維細(xì)胞為(0.85±0.34)%,狹窄模型組尼龍刷刮擦后,循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量增加至(4.92±1.74)%,BMMSCs治療組循環(huán)纖維細(xì)胞顯著低于狹窄模型組(2.04±0.68)%。其中偽手術(shù)組與狹窄模型組(p=0.002)、MSC治療組與狹窄模型組(p=0.0037)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而BMMSCs治療組與偽手術(shù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.2385)。qPCR結(jié)果提示轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β1、白細(xì)胞介素1、Collagen III、腫瘤壞死因子α在造模后第四天顯著升高,BMMSCs治療組與之相比顯著降低,提示BMMSCs治療后局部促炎因子表達(dá)量下降。結(jié)論我們成功地構(gòu)建了良性氣道狹窄的動(dòng)物模型,操作簡(jiǎn)便,造模效果可靠,重復(fù)性好,可作為研究良性氣管狹窄發(fā)生發(fā)展機(jī)制和檢測(cè)治療效果的新工具。我們通過體外共培養(yǎng)-劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí),BMMSCs可加速上皮修復(fù);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,氣道機(jī)械損傷后,局部應(yīng)用BMMSCs能夠降低損傷局部炎癥因子的表達(dá),加速上皮組織修復(fù),抑制肉芽過度增殖,可有效改善氣道狹窄情況,或可作為臨床上良性氣管狹窄治療的新方向。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R56

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 金發(fā)光;;我國(guó)良性氣道狹窄介入治療存在的問題及警告[J];醫(yī)學(xué)爭(zhēng)鳴;2012年06期

2 張耀亭;;良性氣道狹窄治療存在的問題及對(duì)策[J];臨床肺科雜志;2008年12期

3 蔣榮芳;徐明鵬;李莉華;柳廣南;;良性氣道狹窄治療現(xiàn)狀及研究進(jìn)展[J];吉林醫(yī)學(xué);2018年05期

4 李寧;劉春濤;王可;朱輝;;良性氣道狹窄病因分析及治療方式總結(jié)[J];中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2012年02期

5 余麗麗;黎友倫;;良性氣道狹窄的藥物治療進(jìn)展[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2019年35期

6 申楠;季洪健;馮建聰;;氣道內(nèi)支架在良性氣道狹窄中的應(yīng)用進(jìn)展[J];介入放射學(xué)雜志;2016年04期

7 邱容;肖昌武;何正光;;纖維支氣管鏡下球囊擴(kuò)張術(shù)治療良性氣道狹窄[J];華西醫(yī)學(xué);2010年10期

8 陸月蘭;高文君;楊陽(yáng);;全身麻醉下良性氣道狹窄支架植入術(shù)的護(hù)理配合[J];全科護(hù)理;2016年02期

9 蘇柱泉;李時(shí)悅;;良性氣道狹窄治療后再狹窄的原因分析與預(yù)防[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2013年07期

10 邵國(guó)良;肖湘生;;內(nèi)支架在良性氣道狹窄中的應(yīng)用現(xiàn)狀與進(jìn)展[J];介入放射學(xué)雜志;2008年08期

相關(guān)會(huì)議論文 前5條

1 馬驥;韓新巍;吳剛;路慧彬;任建莊;水少鋒;;良性氣道狹窄的介入治療[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十八次全國(guó)放射學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

2 張力;李龍蕓;劉巍;許文兵;郭素青;;金屬支架治療良性氣道狹窄[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第一次全國(guó)介入醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

3 孟繁崢;張俐;王麗娜;王燕;李德麗;;支氣管鏡下球囊擴(kuò)張術(shù)治療兒童良性氣道狹窄81例臨床分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三屆全國(guó)兒科呼吸學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

4 李強(qiáng);;“暫時(shí)性金屬支架植入”治療良性氣道狹窄[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)胸部腫瘤及內(nèi)窺鏡學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

5 王匯;;支氣管鏡球囊擴(kuò)張氣道成形術(shù)治療良性氣道狹窄的護(hù)理[A];全國(guó)內(nèi)科護(hù)理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會(huì)議論文匯編[C];2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 陳思;骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞在良性氣道狹窄中的應(yīng)用前景及治療機(jī)制初探[D];中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2019年

2 蔡志剛;低氧誘導(dǎo)因子-1α在良性氣管狹窄患者瘢痕形成中的作用及機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前7條

1 李峰;兩種良性氣道狹窄動(dòng)物模型建立以及絲裂霉素C對(duì)氣道狹窄的治療作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

2 李陽(yáng);氣管支架在良性氣道狹窄中的應(yīng)用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2017年

3 伍立夫;良性氣道狹窄模型犬的建立及在模型犬中實(shí)施支氣管鏡介入治療技術(shù)的療效對(duì)比分析[D];南華大學(xué);2016年

4 陳善婷;支氣管結(jié)核后氣道狹窄介入治療研究進(jìn)展[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

5 佑航標(biāo);良性氣道狹窄患者氣管鏡介入治療臨床分析[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2016年

6 陳樂城;經(jīng)纖維支氣管鏡取出良性氣管狹窄者置入金屬支架的方法探討[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

7 謝志杰;氣道內(nèi)支架置入術(shù)與球囊擴(kuò)張術(shù)治療良性氣道狹窄20例臨床分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2610596