【摘要】：研究目的良性氣道狹窄是一種威脅生命的呼吸系統(tǒng)疾病。近年來,隨著危重癥醫(yī)學和呼吸支持技術水平的提高,以及肺移植等手術的開展和普及,良性氣道狹窄的發(fā)生率逐漸增高。當前,良性氣道狹窄的治療手段及療效均有限,治療主要包括:手術切除狹窄段及斷端吻合、球囊擴張、冷凍治療、熱消融(YAG或CO_2激光、電凝、氬氣刀)治療、支架置入及局部/系統(tǒng)應用類固醇。以手術治療為金標準,但受狹窄段長度及患者心肺基礎情況的限制,并不適用于所有患者;介入治療的再狹窄率高且需要定期氣管鏡隨訪。良性狹窄的主要發(fā)病機制是氣道粘膜損傷和由成纖維細胞主導的異常修復~([1,2])。該疾病通常始于(感染或非感染因素導致的)氣道粘膜大面積損傷,可伴隨局部出血或血管淤血、伴不同程度的炎癥反應(炎癥細胞募集和炎癥介質釋放),氣道粘膜繼而出現(xiàn)水腫、壞死、脫落、潰瘍,可合并病原體感染。然后,成纖維細胞大量募集和增殖,炎性細胞趨化及浸潤,新生毛細血管血管形成,共同構成新鮮的肉芽組織。最后階段是氣道重塑,成纖維細胞分泌大量膠原纖維,造成膠原沉積,肉芽組織老化脫水,成纖維細胞變成具有收縮表現(xiàn)的肌成纖維細胞,發(fā)生組織攣縮及瘢痕狹窄。成纖維細胞的主要來源:鄰近纖維結締組織中的成纖維細胞遷移、上皮間質化(EMT)及外周血循環(huán)纖維細胞等。我們作出大膽猜想:如若從病變早期即引入治療手段,促進粘膜修復和減輕炎癥,是否可以從根源上緩解或避免肉芽組織過度增生。間充質干細胞(MSCs)兼具促進組織修復及抗炎功能,是治療的絕佳選擇。間充質干細胞(MSCs)是成體干細胞的一種,來源于發(fā)育早期中胚層,具有高度自我更新、多向分化潛能。MSCs治療疾病有多種機制:分化代替、旁分泌、外泌體及線粒體轉移。骨髓是MSCs的重要來源之一,本課題組在骨髓來源間充質干細胞(BMMSCs)研究相關領域積累了豐富的經(jīng)驗。為了研究BMMSCs在良性氣管狹窄治療中的潛力,我們建立了尼龍刷刮擦良性氣管狹窄的SD大鼠模型,應用BMMSCs作為局部治療,并對治療前景和機制進行初步探索。研究方法首先我們采用全骨髓貼壁法進行SD大鼠BMMSCs的原代培養(yǎng),通過流式細胞技術對BMMSCs進行表型鑒定,并進行(成骨、成脂)誘導分化鑒定。采用鏈蛋白酶冷消化法進行SD大鼠氣管-支氣管上皮細胞(TBECs)的原代培養(yǎng),并進行純度鑒定。細胞鑒定后,通過Transwell小室構建SD大鼠BMMSCs與TBECs共培養(yǎng)體系,體外劃痕實驗探索BMMSCs對上皮修復的作用。用人來源BMMSCs與正常人來源支氣管上皮細胞(NHBE)重復上述共培養(yǎng)-劃痕實驗。其次,我們以220g-300g體重的雄性Sprague Dawley大鼠為研究對象,通過尼龍刷刮擦機械性損傷氣道粘膜的方式,建立良性氣管狹窄的SD大鼠模型,觀察造模后大鼠的癥狀體征及生存情況。并通過HE染色及Masson染色,探索造模后不同時間點氣管組織的病理變化。而后在粘膜機械損傷的局部應用1×10~6BMMSCs,通過體內實驗探索BMMSCs對良性氣道狹窄治療的可行性。將SD大鼠分為3組:偽手術組、狹窄模型組(尼龍刷刮擦機械損傷)和BMMSCs治療組(尼龍刷刮擦機械損傷+BMMSCs局部治療),自然死亡的動物即時收集樣本,其余存活動物于造模后第22天統(tǒng)一處死。收集氣管組織,固定于4%磷酸鹽緩沖的多聚甲醛,HE染色后觀察病理改變,并分析評估管腔大小、測算狹窄指數(shù)。另取SD大鼠重復造模及BMMSCs治療,通過HE染色與PAS染色探索造模+BMMSCs局部治療后不同時間點上皮組織的修復情況。最后部分探索了BMMSCs促進上皮修復及預防肉芽組織增生的機制。我們通過CFSE熒光染料標記BMMSCs,機械損傷及BMMSCs ~(CFSE)治療4天后對氣管組織進行冰凍切片、泛角蛋白免疫熒光染色,觀察BMMSCs是否能夠通過直接分化替代的方式來修復上皮結構。另取SD大鼠分為3組:偽手術組、狹窄模型組(尼龍刷刮擦機械損傷)和BMMSCs治療組(尼龍刷刮擦機械損傷+BMMSCs局部治療),第四天處死并收集新鮮外周血及氣管組織。氣管組織進行RNA提取,逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR),用實時聚合酶鏈反應(qPCR)檢查各細胞因子表達水平。由于肉芽組織主要成分為成纖維細胞,而循環(huán)纖維細胞為成纖維細胞主要來源之一,本研究還應用流式細胞學對不同組外周血循環(huán)纖維細胞百分比進行檢測。結果一、大鼠來源細胞實驗部分:劃痕后以DMEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),對照組上皮細胞平均遷移速度為(19.82±5.43)μm/hr,BMMSCs共培養(yǎng)組為(59.42±2.976)μm/hr,p=0.0002,差異有統(tǒng)計學意義。人來源細胞實驗部分:DMEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),單純劃痕組經(jīng)過16h培養(yǎng)后,劃痕愈合速度為(37.91±2.79)μm/hr,MSCs共培養(yǎng)組劃痕愈合速度為(67.60±8.51)μm/hr,p0.0001;大氣道上皮細胞完全培養(yǎng)基重復劃痕實驗,對照組上皮細胞平均遷移速度為(83.92±4.91)μm/hr,BMMSCs共培養(yǎng)組為(124.2±5.55)μm/hr,p0.0001。共培養(yǎng)體系-劃痕實驗證實BMMSCs可加速上皮細胞遷移及修復。二、成功建立尼龍刷刮擦良性氣管狹窄的SD大鼠模型,尼龍刷機械刮擦可嚴重損傷氣道上皮、引起肉芽組織顯著增生及氣管狹窄。造模第8天,大鼠生存率為0,氣管幾乎完全被新生肉芽組織閉塞,而對照組無死亡事件。造模后d2、4、6、8天的氣管組織呈不同期病理改變,與文獻報道的組織損傷修復過程相仿。三、偽手術組狹窄指數(shù)為(5.55±2.71)%,狹窄模型組為(55.87±8.76)%,BMMSCs治療組為(11.12±4.80)%,偽手術組與機械損傷組間狹窄度差異有統(tǒng)計學意義,p0.0001;偽手術組與BMMSCs治療組間狹窄度差異無統(tǒng)計學意義;機械損傷組與BMMSCs治療組間狹窄度差異有統(tǒng)計學意義,p0.0001。21天存活率偽手術組100%,機械損傷組0%,BMMSCs治療組80%。BMMSCs局部應用可促進損傷后的上皮修復,改善肉芽形成從而減輕氣道阻塞,大大降低狹窄指數(shù),提高存活率。四、BMMSCS(CFSE綠色熒光標記)與修復后的上皮(泛角蛋白染色紅色熒光)信號不重合,提示BMMSCs促進上皮修復并非通過直接分化替代的方式。偽手術組大鼠外周血循環(huán)纖維細胞為(0.85±0.34)%,狹窄模型組尼龍刷刮擦后,循環(huán)纖維細胞數(shù)量增加至(4.92±1.74)%,BMMSCs治療組循環(huán)纖維細胞顯著低于狹窄模型組(2.04±0.68)%。其中偽手術組與狹窄模型組(p=0.002)、MSC治療組與狹窄模型組(p=0.0037)間差異有統(tǒng)計學意義,而BMMSCs治療組與偽手術組間差異無統(tǒng)計學意義(p=0.2385)。qPCR結果提示轉移生長因子β1、白細胞介素1、Collagen III、腫瘤壞死因子α在造模后第四天顯著升高,BMMSCs治療組與之相比顯著降低,提示BMMSCs治療后局部促炎因子表達量下降。結論我們成功地構建了良性氣道狹窄的動物模型,操作簡便,造模效果可靠,重復性好,可作為研究良性氣管狹窄發(fā)生發(fā)展機制和檢測治療效果的新工具。我們通過體外共培養(yǎng)-劃痕實驗證實,BMMSCs可加速上皮修復;動物實驗結果提示,氣道機械損傷后,局部應用BMMSCs能夠降低損傷局部炎癥因子的表達,加速上皮組織修復,抑制肉芽過度增殖,可有效改善氣道狹窄情況,或可作為臨床上良性氣管狹窄治療的新方向。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R56

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本文編號：2610596