【摘要】： 前言 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是引起全世界呼吸系疾病發(fā)病率和死亡率不斷上升的重要原因。進(jìn)行性的氣流受限所致的肺功能下降是COPD患者特征性的臨床表現(xiàn),目前對(duì)COPD的藥物治療主要是緩解癥狀或減少并發(fā)癥,而無(wú)有效的方法以阻止其肺功能進(jìn)行性的下降。吸煙是引起COPD的最主要的危險(xiǎn)因素;彈性物質(zhì)的降解則COPD的特征性的病理表現(xiàn)�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases,MMPs)是一類高度保守的依賴于鋅離子和鈣離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族,能夠降解彈性蛋白、蛋白聚糖、Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶在由先天性血清α1-AT(α1-antitrypsin,α1-AT)缺乏所致的COPD的發(fā)病中起著重要作用;而在吸煙相關(guān)的COPD中,肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages,AM)及MMPs的作用越來(lái)越引起人們關(guān)注。因此,本課題主要研究了香煙煙霧和TNF-α對(duì)AM源性MMPs表達(dá)的影響以及核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在MMPs表達(dá)中的作用,從而為COPD的防治提供新的策略。 第一部分被動(dòng)吸煙大鼠巨噬細(xì)胞源性基質(zhì)金屬蛋 白酶的表達(dá)及N-乙酰半胱氨酸對(duì)之的影響分題一香煙煙霧提出物對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞活性及基質(zhì)金屬蛋白酶9和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1平衡的影響 目的: 探討煙霧對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞源性基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)表達(dá)的影響及其在慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)病中的作用。 方法: 制備被動(dòng)吸煙大鼠模型,從支氣管肺泡灌洗液中分離與培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(AM);制備香煙煙霧提出物(CSM),刺激培養(yǎng)的AM。以二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽比色(MTT)法檢測(cè)CSM對(duì)AM活性的影響;以半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)MMP-9和TIMP-1 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果: CSM的濃度低于5%時(shí),CSM對(duì)AM無(wú)顯著的細(xì)胞毒性;當(dāng)CSM濃度超過(guò)5%時(shí),CSM對(duì)AM的細(xì)胞毒性顯著增加。當(dāng)CSM濃度低于5%,隨著CSM濃度的增加,MMP-9、TIMP-1 mRNA表達(dá)相應(yīng)增加;當(dāng)CSM濃度高于5%時(shí),MMP-9、TIMP-1 mRNA表達(dá)則相應(yīng)下降,組間存在顯著性差異(P0.05)。以5%CSM刺激AM,在24h內(nèi),隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),MMP-9 mRNA的表達(dá)也相應(yīng)增加,TIMP-1 mRNA的表達(dá)則先增加后下降,組間存在顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論: CSM能誘導(dǎo)AM源性MMP-9和TIMP-1 mRNA的表達(dá),并導(dǎo)致其平衡失調(diào);CSM誘導(dǎo)的AM源性MMP-9和TIMP-1之間的平衡失調(diào)在吸煙相關(guān)的COPD發(fā)病中可能起著重要作用。 分題二N-乙酰半胱氨酸對(duì)吸煙大鼠巨噬細(xì)胞源性明膠酶和巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶表達(dá)的影響 目的 研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)香煙煙霧提出物誘導(dǎo)的吸煙大鼠肺泡巨噬細(xì) 目的 研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)香煙煙霧提出物誘導(dǎo)的吸煙大鼠肺泡巨噬細(xì)胞源性明膠酶、巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶mRNA表達(dá)及明膠酶活性的影響。 方法 制備被動(dòng)吸煙大鼠模型,從支氣管肺泡灌洗液中分離與培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(AM);制備香煙煙霧提出物(CSM),刺激培養(yǎng)的AM。以半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)明膠酶A(MMP-2)、明膠酶B(MMP-9)及巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶(MMP-12)mRNA的表達(dá);以明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2、MMP-9酶活性水平。 結(jié)果 在一定范圍內(nèi),隨著CSM刺激濃度的增加MMP-2、MMP-9、MMP-12 mRNA表達(dá)相應(yīng)顯著增加(P0.05);但當(dāng)CSM濃度過(guò)高時(shí),MMP-2、MMP-9、MMP-12mRNA表達(dá)則下降(P0.05)。當(dāng)以5%CSM刺激AM時(shí),在24 h內(nèi),隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),MMP-9、MMP-12 mRNA的表達(dá)也相應(yīng)增加,MMP-2 mRNA的表達(dá)則先增加后下降(P0.05)。未用CSM刺激前,MMP-2、MMP-9酶活性水平均較低,而當(dāng)以CSM刺激后,MMP-2、MMP-9、MMP-12 mRNA水平則顯著升高,以MMP-9更明顯。NAC能顯著抑制CSM誘導(dǎo)的AM源性MMP-2、MMP-9、MMP-12 mRNA的表達(dá)(P0.05),且MMP-2、MMP-9酶活性也隨NAC劑量增加而降低,NAC劑量愈高,AM源性MMP-2、MMP-9、MMP-12 mRNA表達(dá)水平愈低。 結(jié)論 NAC在一定程度上可以抑制CSM誘導(dǎo)的AM源性MMP-2、MMP-9、MMP-12mRNA的表達(dá),且使明膠酶活性水平相應(yīng)降低。第二部分TNF-α誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病患者肺泡 巨噬細(xì)胞源性基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究 分題一核因子κB在TNF-α誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病患者 肺泡巨噬細(xì)胞源性基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)中的作用 目的 探討核因子KB(NF-κB)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在TNF-α誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病患者肺泡巨噬細(xì)胞(AM)源性基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)中的作用。 方法 從慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者或健康志愿者支氣管肺泡灌洗液中分離與培養(yǎng)AM,以吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理1.5 h,接著再以TNF-α刺激24 h。以半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)MMP-9、MMP-2、TIMP-1 mRNA表達(dá);以明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2、MMP-9酶活性水平;以Western blotting檢測(cè)MMP-9蛋白的表達(dá);以凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)NF-κB活性。 結(jié)果 以TNF-α刺激健康志愿者及COPD患者AM后, MMP-9和MMP-2 mRNA表達(dá)水平及明膠酶活性均隨著TNF-α刺激劑量的增加而相應(yīng)增加(P0.05),而TIMP-1 mRNA的表達(dá)則隨著TNF-α刺激劑量的先增加而后出現(xiàn)降低;且COPD患者的MMP-9、MMP-2、TIMP-1 mRNA水平及明膠酶活性較健康志愿者增加更為顯著。而若以PDTC或NAC預(yù)處理AM 1.5 h,再以TNF-α刺激,TNF-α誘導(dǎo)的COPD患者AM源性MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)則隨著PDTC或NAC劑量的增加而顯著性下降,組間差異存在顯著性(P0.05)。以TNF-α刺激離體培養(yǎng)的COPD患者AM時(shí),NF-κB的活性顯著增加(P0.05);PDTC和NAC則能顯著抑制TNF-α刺激引起的NF-κB的活化(P0.05)。 結(jié)論 TNF-α能上調(diào)AM源性MMP-9、MMP-2和TIMP-1 mRNA的表達(dá);PDTC和NAC則能抑制TNF-α刺激誘導(dǎo)的AM源性MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá);NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在TNF-α誘導(dǎo)的AM源性MMP-9的表達(dá)中起著重要作用。 分題二吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽和N-乙酰半胱氨酸抑制核因子κB活化的作用機(jī)理研究 目的 研究吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)TNF-α或IL-1誘導(dǎo)的IKKα、IKKp和IκBα的磷酸化及NF-κB活化的影響,從而探討PDTC和NAC抑制NF-κB活化的藥學(xué)機(jī)理。 方法 從慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者支氣管肺泡灌洗液中分離與培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞(AM),以PDTC或NAC和AM共孵育1.5 h,接著以TNF-a或IL-1刺激90 min。以Western blotting檢測(cè)IKKa、IKKβ和IκBα自磷酸化水平;以凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)NF-κB的活化水平。 結(jié)果 NAC能顯著抑制由TNF-α誘導(dǎo)的IKKα、IKKβ和IKBα的磷酸化(P0.05),而對(duì)IL-1誘導(dǎo)的IKKα、IKKβ和IκBα的磷酸化則沒(méi)有顯著的抑制作用(P0.05)。PDTC對(duì)TNF-α或IL-1誘導(dǎo)的IκBα的磷酸化均無(wú)顯著的抑制作用(P0.05)。NAC能顯著抑制由TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的活化(P0.05),而對(duì)IL-1誘導(dǎo)的NF-κB的活化則沒(méi)有顯著的抑制作用(P0.05);而PDTC則對(duì)TNF-α或IL-1誘導(dǎo)的NF-κB的活化均有顯著的抑制作用(P0.05)。PDTC和NAC均不能在體外直接抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性(P0.05)。 結(jié)論 NAC能抑制引起IKK活化的上游,從而阻斷TNF-α刺激的NF-κB的活化過(guò)程;PDTC則通過(guò)抑制IκBα的降解、阻止IκB和NF-κB復(fù)合體的解離,從而抑制NF-κB的活化。NAC和PDTC作為NF-κB活化的抑制劑,與其抗氧化特性無(wú)直接關(guān)系。第三部分核酸鎖修飾的核因子KB誘捕寡核甘酸對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞源性基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的影響 目的 研究核酸鎖(LNA)修飾的NF-κB誘捕寡核甘酸(ODNs)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺泡巨噬細(xì)胞(AM)源性MMP-9、MMP-2表達(dá)以及NF-κB活性的影響。 方法 從COPD患者支氣管肺泡灌洗液中分離與培養(yǎng)AM,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NF-κB誘捕(decoy)ODNs和NF-κB錯(cuò)配ODNs,接著以TNF-α刺激AM。以半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)MMP-9、MMP-2 mRNA的表達(dá);以Western blotting檢測(cè)MMP-9蛋白的表達(dá);以凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)NF-κB活性。 結(jié)果 NF-κB decoy ODNs顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的AM源性MMP-9、MMP-2 mRNA及MMP-9蛋白的表達(dá)(P0.05);錯(cuò)配ODNs則對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的AM源性MMP-9、MMP-2 mRNA以及MMP-9蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響(P0.05)。NF-κB decoy ODNs顯著降低TNF-α刺激所致的NF-κB活性水平(P0.05),而錯(cuò)配ODNs則對(duì)TNF-α刺激所致的NF-κB活性水平無(wú)顯著影響(P0.05)。 結(jié)論 LNA修飾的NF-κB decoy ODNs能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的AM源性MMP-9的表達(dá);LNA修飾和decoy ODNs為COPD的治療提供了新的思路。
【圖文】：

G:模型組見(jiàn)吞噬煙塵的巨噬細(xì)胞(HEx400)H:模型組見(jiàn)吞噬煙塵的巨噬細(xì)胞(l正xl000)圖1正常組和模型組大鼠的肺支氣管肺組織(xl00)被動(dòng)吸煙大鼠的AM(x200)被動(dòng)吸煙大鼠的AM

emsa染色x400)D:被動(dòng)吸煙大鼠的AM(以emsa染色、400)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R563.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 李亞清,張珍祥,徐永健,倪望,陳仕新,馬丹,楊朝;香煙提取物對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞活性及基質(zhì)金屬蛋白酶9和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1平衡的影響[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2005年09期

2 李亞清;張珍祥;徐永健;趙建平;倪望;陳仕新;楊朝;葉濤;;核因子κB在肺泡巨噬細(xì)胞源性基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)中的作用[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2005年12期

3 許三林,吳人亮,陳春蓮,郝春榮;上皮鈣粘附素在吸煙小鼠呼吸道上皮損傷修復(fù)中表達(dá)的研究[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;1999年07期

4 李亞清;張珍祥;徐永健;熊盛道;楊朝;倪望;陳仕新;馬丹;;COPD患者肺泡巨噬細(xì)胞源性MMP-9的表達(dá)及其酶活性變化[J];中華內(nèi)科雜志;2006年01期

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本文編號(hào)：2610259