【摘要】：目的:探究在模擬最適氣道剪應(yīng)力的作用下Cortactin不同關(guān)鍵磷酸化位點對MUC5AC分泌的影響。方法:(1)構(gòu)建野生型CTTN的PTSB質(zhì)粒,通過對CTTN基因(Cortactin gene,皮層肌動蛋白基因)主要關(guān)鍵酪磷酸化位點(Y421、Y470、Y486)進行定點突變,將原來酪氨酸殘基替換為成丙氨酸(A),模擬相關(guān)位點非磷酸化狀態(tài)。構(gòu)建重組質(zhì)粒PTSB02-GFP-CTTN-Y421A、PTSB02-GFP-CTTN-Y470A、PTSB02-GFP-CTTN-Y486A、PTSB02-GFP-CTTN,酶切鑒定并測序。(2)剪應(yīng)力模擬裝置參考Tarran等的實驗研究,采用相位運動儀器,通過不斷加速/減速交替進行的方式模擬人體呼吸過程中呼氣與吸氣的交替對氣道上皮的剪應(yīng)力作用。通過對調(diào)節(jié)加速/減速的時間和頻率模擬病理狀態(tài)下增大的剪應(yīng)力和呼吸頻率。為模擬病理狀態(tài)下氣流對氣道上皮細胞的剪應(yīng)力作用,本實驗把加速/減速的參數(shù)設(shè)置為1.2 s/次,30次/min,作用35 min。(3)人支氣管上皮細胞(16HBE)置于37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取狀態(tài)好的細胞以5×10~5個細胞/孔種于6孔板中,置于37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待16HBE細胞生長至匯合度達70%左右時,隨機分成6組:組(A)Y421A、組(B)Y470A、組(C)Y486A、組(D)野生型CTTN、組(E)空白質(zhì)粒陰性對照、組(F)空白對照。使用lipo3000試劑轉(zhuǎn)染16HBE細胞。孵育24 h后施予剪應(yīng)力刺激,放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后分析轉(zhuǎn)染細胞,進行相關(guān)實驗檢測。(4)采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting,WB)檢測Cortactin、p-Cortactin Y421、p-Cortactin Y470、p-Cortactin Y486蛋白相對表達水平;采用RT-PCR檢測其Cortactin基因mRNA相對表達水平,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細胞外MUC5AC的相對分泌量。結(jié)果:(1)經(jīng)基因測序及酶切鑒定,CTTN基因主要磷酸化位點(Y421、Y470、Y486)定點突變成功,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒(PTSB02-GFP-CTTN-Y421A、PTSB02-GFP-CTTN-Y470A、PTSB02-GFP-CTTNY486A、PTSB02-GFP-CTTN),可用于后續(xù)實驗。(2)通過Lipo3000試劑轉(zhuǎn)染,熒光顯微鏡觀察提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功,轉(zhuǎn)染效率均達80%以上。(3)熒光定量PCR檢測各組細胞中Cortactin基因mRNA的表達水平:與陰性對照及空白對照比較,各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞中Cortactin mRNA表達水平明顯升高;各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組之間相比,各組表達Cortactin mRNA表達水平基本相同。(4)ELISA測定各組細胞MUC5AC胞外分泌量:A組中MUC5AC胞外分泌水平顯著低于B組、C組、D組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),B組MUC5AC胞外分泌水平低于D組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),A組MUC5AC胞外分泌水平顯著高于E組、F組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),C組與D組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),E組與F組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(5)Western Blotting檢測各組細胞中Cortactin蛋白及p-Cortactin Y421、p-Cortactin Y470、p-Cortactin Y486蛋白相對水平:與E、F組比較,A、B、C、D組Cortactin蛋白表達水平明顯增高,各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組之間比較,Cortactin相對表達水平基本相同;與B、C、D組比較,A組p-Cortactin Y421蛋白相對表達顯著降低;各組細胞中p-CortactinY470及p-CortactinY486的相對含量與胞外MUC5AC分泌無明顯相關(guān)性。結(jié)論:模擬氣道剪應(yīng)力作用下Cortactin磷酸化位點Y421的磷酸化促進MUC5AC的分泌作用最強;Y470的磷酸化對MUC5AC的分泌有一定促進作用;Y486的磷酸化對MUC5AC的分泌幾乎無作用。
【圖文】：

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 林宇斌131.3 實驗方法1.3.1 實驗流程圖1.3.2 16HBE 細胞的培養(yǎng)操作前紫外消毒超凈臺試劑置于 37℃的水浴箱內(nèi)平衡溫度1.3.2.1 細胞復(fù)蘇1）將保存于-80℃的凍存細胞取出。2）迅速放入 36℃～37℃水浴，不斷輕輕小幅度晃動，使其急速融化，30 s-60 s內(nèi)完成。3）將凍存管酒精消毒后，吸取細胞于離心管中，加入完全培養(yǎng)基。4）低速離心 1000 r/min 5 min，去上清后再加入 5 mL 培養(yǎng)基稀釋，吹打均勻。人氣道上皮細胞 16HBE 培養(yǎng)PTSB02-GFP-CTTN 重組質(zhì)粒并擴增構(gòu)建 Cortactin 磷酸化位點定點突變質(zhì)粒，酶切并測序（Y421A、Y470A、Y486A）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 16HBE 細胞并培養(yǎng)Y421A Y470A Y486A野 生 型CTTN 組陰性對照組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）空白對照組（培養(yǎng)正常 16HBE）PCR 檢測 Cortactin mRNA 表達水平，，ELISA 檢測細胞外MUC5AC 分泌量，WB 分別檢測內(nèi)細胞內(nèi) Cortactin 及p-Cortactin Y421A、Y470A、Y486A 蛋白相對表達水平。施予剪應(yīng)力作用

圖 2 PTSB02-GFP-PURO 質(zhì)粒Figure 2 PTSB02-GFP-PURO Plasmid 點突變據(jù)試劑盒說明書，配置如下 PCR 反應(yīng)體系表 8 PCR 反應(yīng)體系Table 8 PCR reaction system試劑 體積10× reaction buffer 5 μLSample plasmid （10 ng/μL） 2 μLForward primer (F) （10 pmol/μL) 1 μLReverse primer (R) （10 pmol/μL) 1 μLdNTP mixture（each 2.5 mM） 2 μLddHO 38 μL
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R56

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李恒;馮雨;黃云超;陳穎;戴春;張祥武;;Cortactin在非小細胞肺癌中的表達及其與臨床特征的關(guān)系探討[J];腫瘤預(yù)防與治療;2013年05期

2 張彤彤;梁建偉;王征;張鈺;劉一臻;商利;楊海;蔡巖;徐昕;王明榮;;Cortactin蛋白在結(jié)直腸癌中的表達變化及其臨床意義[J];癌變.畸變.突變;2014年01期

3 于涓瀚;王恩華;;cortactin在非小細胞肺癌中的表達及意義[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2013年01期

4 林宇斌;仲艾芳;劉勝華;陳微微;曾廣會;溫建立;;皮層肌動蛋白結(jié)合蛋白Cortactin研究進展[J];吉林醫(yī)學(xué);2018年12期

5 錢飛;毛勤生;朱建偉;;結(jié)腸癌細胞內(nèi)吞活動中癌基因產(chǎn)物cortactin的作用[J];腫瘤防治研究;2009年03期

6 趙剛;張洪義;孔亞林;李宇;;Cortactin基因的表達及其與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J];腫瘤防治研究;2010年11期

7 劉坤;羅方秀;方旭前;施毅卿;蔣奕玫;陳培戰(zhàn);趙任;;Cortactin表達與結(jié)腸直腸癌腫瘤出芽的相關(guān)研究[J];外科理論與實踐;2018年05期

8 姚嬋;劉益飛;章建國;張曙;張青;黃華;;Cortactin在浸潤性乳腺癌組織中的表達及其臨床意義[J];腫瘤學(xué)雜志;2015年01期

9 王常剛;劉坤;蔡健華;季曉頻;劉炳亞;朱正綱;趙任;;Cortactin過表達對結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響[J];外科理論與實踐;2012年01期

10 朱建偉;趙任;;沉默Cortactin表達對大腸癌細胞伸展、遷移和侵襲的抑制[J];世界華人消化雜志;2009年12期

相關(guān)會議論文 前1條

1 王聞起;丁宇波;陳路蕓;劉楊;廖侃;;Src磷酸化微絲結(jié)合蛋白cortactin在細胞分裂以及細胞遷移中的作用[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會-2011年學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 趙剛;Cortactin調(diào)節(jié)MMPs分泌促進肝癌細胞侵襲性機制的實驗研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2013年

2 劉春漪;拴鏈因子Exocyst與皮層肌動結(jié)合蛋白Cortactin在黏液高分泌中的耦聯(lián)效應(yīng)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

3 南剛;癌細胞片狀偽足形成的惡性行為表型及其分子機制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前9條

1 林宇斌;Cortactin不同磷酸化位點在模擬氣道剪應(yīng)力作用下對氣道黏液分泌的影響[D];遵義醫(yī)科大學(xué);2019年

2 許朱定;反義cortactin基因真核表達載體的構(gòu)建及其對肝癌細胞侵襲作用的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

3 錢飛;結(jié)腸癌細胞內(nèi)吞活動中癌基因產(chǎn)物cortactin的作用研究[D];南通大學(xué);2008年

4 常輝;Cortactin在幽門螺桿菌VacA致凋亡中的作用及其機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2014年

5 譚桂煌;siRNA抑制cortactin基因表達對喉癌Hep-2細胞增殖和侵襲的影響[D];南華大學(xué);2010年

6 張磊;Smad4信號通路蛋白與Cortactin蛋白在卵巢腫瘤中的表達及意義[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2014年

7 黃曉丹;人肝細胞肝癌組織中Smad4、Fascin、Cortactin蛋白的表達及其對臨床預(yù)后判斷價值的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

8 魏巍;喉鱗癌組織中HDAC6、α-Tubulin、HSP90、Cortactin的表達及臨床意義[D];華北理工大學(xué);2017年

9 郝曉玲;嗎啡對大鼠海馬神經(jīng)元肌動蛋白重構(gòu)的影響及機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2600388