【摘要】： 目的: 肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是機(jī)體對肺組織損傷的過度修復(fù)和重塑的病理結(jié)果,而肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts, MFbs)正是導(dǎo)致膠原大量分泌、組織過度修復(fù)的主要效應(yīng)靶細(xì)胞,其在間質(zhì)中數(shù)量增加并持續(xù)活化被認(rèn)為是病程向纖維化進(jìn)展的重要標(biāo)志。MFbs主要由間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞(fibroblasts, Fbs)轉(zhuǎn)化而來,后者在缺氧、促纖維化細(xì)胞因子等因素的誘導(dǎo)下表達(dá)MFbs的特征性蛋白分子——α-SMA,從而轉(zhuǎn)化為MFbs,發(fā)揮更強(qiáng)的致纖維化作用,因此,大量活化的Fbs轉(zhuǎn)化為致纖維化能力更強(qiáng)的MFbs的病理過程是PF進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)�；仡櫸墨I(xiàn)發(fā)現(xiàn),肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)作為血管壁基本的結(jié)構(gòu)和功能單位,是血管屏障的重要組成部分,它不僅在生理狀態(tài)下調(diào)節(jié)血管內(nèi)外的物質(zhì)交換、穩(wěn)定機(jī)體的內(nèi)環(huán)境;還在病理狀態(tài)下超早期的發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)組織修復(fù)。然而,它在消除致病因子對機(jī)體損傷的同時也可能由于某種原因而過度地發(fā)揮了介導(dǎo)免疫、炎癥反應(yīng),加重組織缺氧,分泌過量細(xì)胞因子等生物學(xué)作用,從而促進(jìn)了組織的纖維性修復(fù)。文獻(xiàn)顯示,上述病態(tài)的PMVECs功能可能在Fbs向MFbs轉(zhuǎn)化的病理過程發(fā)揮著重要作用,本實驗將采用ELISA、Western Blot、RT-PCR等方法檢測PMVECs中相關(guān)細(xì)胞因子的合成、分泌水平,并使用millicell細(xì)胞共培養(yǎng)體系,結(jié)合抗體中和試驗,研究體外共培養(yǎng)條件下,BLM大鼠PMVECs對Fbs的生物學(xué)作用及其機(jī)制,進(jìn)一步揭示PMVECs及其功能表型變化在PF早期病程中的作用。 方法: SD大鼠,體重100±20 g,雄性,以博萊霉素(Bleomycin,BLM)-A5溶液氣管內(nèi)灌注的方法誘導(dǎo)大鼠PF模型,并在相同條件下向正常大鼠氣管內(nèi)灌注等體積生理鹽水作為對照。分別于給藥后第3,7,14,21和28天處死大鼠,取外周肺組織留作原代培養(yǎng)PMVECs和Fbs,其余肺組織用10 g/L多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片、VG染色。在各時間點原代培養(yǎng)PMVECs和Fbs后,利用ELISA、Western Blot、RT-PCR等方法檢測各組大鼠PMVECs合成、分泌細(xì)胞因子TGF-β1及CTGF的水平;并將各組大鼠PMVECs分別與預(yù)先培養(yǎng)、傳代的對照組大鼠Fbs共培養(yǎng),采用細(xì)胞生長曲線測定、PCNA免疫組化染色、流式細(xì)胞染色、Western Blot等方法,檢測共培養(yǎng)后的Fbs的增殖、轉(zhuǎn)化及膠原合成能力,并以單培養(yǎng)的各組大鼠Fbs的相應(yīng)功能作為陽性對照,進(jìn)行比較分析;結(jié)合細(xì)胞因子抗體中和試驗檢測PMVECs細(xì)胞因子分泌功能的變化與其促Fbs增殖、轉(zhuǎn)化功能的相關(guān)關(guān)系。 結(jié)果: 1、BLM大鼠PMVECs的對數(shù)生長期較對照組大鼠PMVECs提前。 2、免疫熒光染色及Western Blot檢測證實BLM誘導(dǎo)大鼠PF過程中PMVECs上調(diào)TGF-β1和CTGF蛋白的表達(dá),且高峰出現(xiàn)在BLM氣管內(nèi)灌注后7天組PMVECs。經(jīng)RT-PCR鑒定,BLM氣管內(nèi)灌注后7天組PMVECs中TGF-β1和CTGF的轉(zhuǎn)錄顯著升高。ELISA實驗證實,各組PMVECs培養(yǎng)上清中TGF-β1和CTGF的分泌水平與Western Blot檢測的細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平基本一致。 3、細(xì)胞免疫熒光染色及Western Blot檢測證實BLM大鼠PMVECs中出現(xiàn)α-SMA蛋白的表達(dá),其高峰亦位于BLM氣管內(nèi)灌注后7天組。4、生長曲線及PCNA染色顯示與BLM氣管內(nèi)灌注后7、14、21、28天組PMVECs共培養(yǎng)的Fbs的對數(shù)生長期提前,核增殖能力明顯高于對照組。流式細(xì)胞染色及Western Blot結(jié)果顯示與BLM氣管內(nèi)灌注后7天組PMVECs共培養(yǎng)的Fbs群中,MFbs數(shù)量顯著增加,α-SMA蛋白的表達(dá)亦明顯上調(diào);與BLM氣管內(nèi)灌注后7、14天組PMVECs共培養(yǎng)的Fbs中ColⅠA1的表達(dá)顯著上調(diào)。 5、抗體中和試驗顯示,單獨使用TGF-β1抗體使共培養(yǎng)上清中TGF-β1的濃度下降約53.15±8.91%,可使共培養(yǎng)的Fbs數(shù)量減少約23.39±2.12%,Fbs群中MFbs百分比下降約4.68±0.86%(降幅約22.48%);單獨使用CTGF抗體使共培養(yǎng)上清中CTGF的濃度下降約54.65±10.24%,可使共培養(yǎng)的Fbs數(shù)量減少約45.16±5.79%,Fbs群中MFbs百分比下降約8.06±1.31%(降幅約38.71%);而聯(lián)合使用TGF-β1和CTGF抗體使共培養(yǎng)上清中TGF-β1和CTGF濃度同比下降約50%,可使共培養(yǎng)的Fbs數(shù)量減少約73.39±11.89%,Fbs群中MFbs百分比下降約10.15±1.37%(降幅約48.75%)。 結(jié)論: 1、BLM誘導(dǎo)的大鼠PF過程中,PMVECs合成、分泌促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1及CTGF的功能上調(diào),尤其在病程早期,PMVECs合成、分泌細(xì)胞因子功能旺盛,細(xì)胞以分泌功能表型為主。 2、在體外共培養(yǎng)條件下,BLM大鼠PMVECs可促進(jìn)正常鼠Fbs的增殖、轉(zhuǎn)化及膠原合成,并以BLM氣管內(nèi)灌注后7天大鼠PMVECs的促Fbs增殖作用最強(qiáng)。 3、以TGF-β1及CTGF高表達(dá)為代表的PMVECs表型異常是促進(jìn)Fbs活化、增殖并轉(zhuǎn)化為MFbs,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度分泌的重要原因;也可能是生理狀態(tài)下早期激活間質(zhì)中靜止的Fbs,并促進(jìn)其發(fā)揮致纖維化作用的關(guān)鍵因素。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文維使肺泡具有彈性，以便吸氣時擴(kuò)大的肺泡在呼氣時有良好的回縮力。肺間質(zhì)內(nèi)有單核細(xì)胞分化而來的肺巨噬細(xì)胞，該細(xì)胞有重要的防御作用，能吞噬吸入的灰塵、細(xì)菌、異物及滲出的紅細(xì)胞。肺毛細(xì)血管多為連續(xù)型，管徑約 7-10μm。組成肺毛細(xì)血管的 EC 為單層扁平 EC，胞質(zhì)薄、細(xì)胞器少，但有大量吞飲小泡，可參與蛋白分子的轉(zhuǎn)運。肺毛細(xì)血管 EC 間有緊密連接（tight junction，TJ）和縫隙連接，具有調(diào)節(jié)血管通透性的作用。肺泡隔內(nèi)毛細(xì)血管 EC、毛細(xì)血管基膜、薄層結(jié)締組織、Ⅰ型肺泡細(xì)胞與基膜、肺泡表面液體層組成總厚度為 0.2-0.5μm 的氣血屏障（blood-air barrier），便于肺泡內(nèi)的 O2與血液中的 CO2進(jìn)行交換。

圖 2 ATⅡ與 MFb 關(guān)系模式圖3、炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞 （inflammatory cells and immunologic cells）的促纖維化作用不同的炎癥或免疫細(xì)胞在 PF 的不同階段發(fā)揮作用。PF 早期，，病理表現(xiàn)為急性炎癥滲出，可見中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞在肺泡中浸潤；而在纖維化形成期，病理表現(xiàn)為組織的纖維性修復(fù)，可見肺間質(zhì)中巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤。（1） 中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞是肺泡炎期的主要效應(yīng)細(xì)胞，它一方面可幫助機(jī)體清除致炎因子，吞噬壞死組織，促進(jìn)組織修復(fù)；另一方面卻釋放氧自由基等活性物質(zhì)造成組織的炎癥損傷。在纖維化的肺泡炎階段，中性粒細(xì)胞釋放大量的氧自由基、膠原酶和蛋白酶，損傷、破壞肺組織的正常結(jié)構(gòu)；它釋放的這些酶類物質(zhì)進(jìn)一步代謝，可合成、分泌白三烯、凝血烷、硫酸軟骨素、
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R563

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本文編號：2599410