【摘要】：研究背景：結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的一種慢性傳染病。結(jié)核病疫情下降緩慢,肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis, PTB)仍是影響全球特別是發(fā)展中國(guó)家公共衛(wèi)生的重大傳染疾病,急需新的策略提高肺結(jié)核的早期診斷質(zhì)量。生物標(biāo)志物對(duì)于疾病的篩查、診斷、預(yù)后、療效判斷以及檢測(cè)十分重要,因此,尋找更為靈敏的特征性的生物標(biāo)志物是早期診斷肺結(jié)核的當(dāng)務(wù)之急。蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為從整體水平分析血清蛋白質(zhì)提供了技術(shù)平臺(tái),表面加強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)、線性液質(zhì)聯(lián)用離子解串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(linear ion chromatograph mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS)技術(shù),作為全新的蛋白組學(xué)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)血清中特異性標(biāo)志物的篩選和鑒定。 研究方法：采用弱陽(yáng)離子(weak cation exchange, WCX)磁珠結(jié)合SELDI-TOFMS技術(shù)建立180例初治繼發(fā)性肺結(jié)核患者和211例對(duì)照的血清蛋白指紋圖譜,應(yīng)用Biomarker Pattern Software (BPS)軟件建立肺結(jié)核的診斷模型。通過(guò)反相高效液相色譜(reverse phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC)分離及純化潛在的生物標(biāo)志物蛋白,應(yīng)用MALDI-TOF MS跟蹤目標(biāo)蛋白,進(jìn)一步用線性液質(zhì)聯(lián)用離子肼串聯(lián)質(zhì)譜(linear ion chromatograph mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS)進(jìn)行分析,以鑒定潛在診斷標(biāo)志物蛋白,并用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進(jìn)行驗(yàn)證。 研究結(jié)果：120例肺結(jié)核和120例非肺結(jié)核(60例健康對(duì)照、20例肺癌、20例肺炎、20例慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD))血清蛋白圖譜比較,35個(gè)蛋白峰在肺結(jié)核和非肺結(jié)核組之間有顯著差異(P0.01,Fold≥1.5)。篩選2554.6,4824.4,5325.7和8606.8m/z四個(gè)蛋白峰構(gòu)建了診斷模型Ⅰ,靈敏度為83.3%,特異度為84.2%,該模型顯示在肺結(jié)核臨床大規(guī)模的篩查具有較好的診斷能力,盲法檢驗(yàn)靈敏度為75.0%,特異度為83.5%。以120例肺結(jié)核患者和60例肺結(jié)核其他疾病(肺癌、肺炎、COPD)篩選的差異峰為基礎(chǔ)構(gòu)建了由4180.1,5325.7,15103.6m/z3個(gè)蛋白峰組成的診斷模型Ⅱ,靈敏度為87.5%,特異度為90.0%。該模型在臨床上對(duì)于有相似癥狀以及相似影像學(xué)改變的肺結(jié)核和其他肺部疾病的鑒別具有更強(qiáng)的應(yīng)用性,該模型盲法靈敏度為81.7%,特異度為85.0%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為84.5%。在肺結(jié)核中相對(duì)高表達(dá)的2554.6m/z蛋白峰經(jīng)RP-HPLC分離純化,并利用MALDI-TOF MS及LC-MS/MS進(jìn)行鑒定,為纖維蛋白原(fibrinogen, alpha polypeptide isoform alpha-E preproprotein)的一個(gè)片段。血清ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)肺結(jié)核組的纖維蛋白原降解產(chǎn)物(fibrinogen degradation product, FDP)量均值高于健康對(duì)照組(5,005±1,297vs.4,010±1,181ng/mL,P＜0.05),142例臨床隨機(jī)收集的肺結(jié)核病人血漿中的纖維蛋白原含量(5.45±1.65g/L)要高于正常值范圍(2.0-4.0g/L)。 結(jié)論：(1)建立納米磁珠結(jié)合SELDI-TOF MS的肺結(jié)核蛋白指紋圖譜檢測(cè)技術(shù),可快速穩(wěn)定靈敏地構(gòu)建肺結(jié)核蛋白指紋圖譜；建立了RP-HPLC聯(lián)合MALDI-TOF MS、LC-MS/MS鑒定SELDI-TOF MS特異差異峰技術(shù)。(2)篩選了肺結(jié)核相關(guān)的差異蛋白峰,構(gòu)建了肺結(jié)核早期診斷的蛋白診斷模型,為建立肺結(jié)核病臨床早期快速特異診斷的血清蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)準(zhǔn),提高肺結(jié)核病的防治水平奠定基礎(chǔ)。(3)鑒定和驗(yàn)證了纖維蛋白原可能為肺結(jié)核早期診斷的潛在生物標(biāo)志物之一,為臨床肺結(jié)核早期診斷奠定了基礎(chǔ)。 研究背景：肺結(jié)核屬于中醫(yī)學(xué)“肺癆”范疇,目前用于肺結(jié)核治療的化學(xué)藥物雖有療效但毒副作用大且易形成耐藥性,而中醫(yī)基于患者機(jī)體正虛和癆蟲(chóng)感染辨證施治,尤其是近年來(lái)中西醫(yī)結(jié)合治療在耐藥肺結(jié)核和疑難重癥肺結(jié)核治療中取得了一定的療效。證候是中醫(yī)辨證施治的核心,肺結(jié)核中醫(yī)證候的診斷尚無(wú)科學(xué)量化的標(biāo)準(zhǔn),嚴(yán)重影響臨床治療效果。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的很多特征如整體性、動(dòng)態(tài)性、時(shí)空性、復(fù)雜性等與中醫(yī)證候的特點(diǎn)十分吻合,以蛋白質(zhì)組為切入點(diǎn),深入進(jìn)行證候?qū)嵸|(zhì)的研究,有利于從微觀的角度動(dòng)態(tài)地了解證候的物質(zhì)基礎(chǔ),可為中醫(yī)證候診斷分型的客觀化提供依據(jù)。 研究方法：采用中醫(yī)獨(dú)立四診辨證結(jié)合舌診儀脈診儀對(duì)180例肺結(jié)核患者進(jìn)行辨證分型,納入肺陰虛證(FYX)71例,陰虛火旺證(YXHW)64例,氣陰兩虛證(QYLX)45例。采用WCX磁珠結(jié)合SELDI-TOF MS技術(shù)建立血清蛋白指紋圖譜,應(yīng)用Biomarker Wizard軟件比較各證候間的差異峰并進(jìn)行證候共性分析。應(yīng)用BPS軟件建立肺結(jié)核證候的辨證模型。通過(guò)RP-HPLC分離及純化潛在的生物標(biāo)志物蛋白,應(yīng)用MALDI-TOF MS和LC-MS/MS進(jìn)行分析,以鑒定潛在證候標(biāo)志物蛋白,并用蛋白芯片技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。 研究結(jié)果：50例FYX證、40例YXHW證、30例QYLX證血清蛋白指紋圖譜兩兩比較并作共性分析,FYX證與與其他兩證候比較均存在差異的蛋白峰有12個(gè)(P0.001), YXHW證與其他兩證候比較均存在差異的蛋白峰有12個(gè)(P0.001),QYLX證與其他兩證候比較均存在差異的蛋白峰有34個(gè)(P0.001)；有7個(gè)蛋白峰在三證間的含量呈肺陰虛→陰虛火旺→氣陰兩虛逐漸降低變化。以三證候間兩兩有差異的74個(gè)差異峰(P0.001)為基礎(chǔ)構(gòu)建了由3961.7、4679.7、5646.4、8891.2、9416.7m/z5個(gè)蛋白標(biāo)志峰組成的肺結(jié)核中醫(yī)證候蛋白質(zhì)指紋圖譜辨證模型,對(duì)于FYX證辨證的準(zhǔn)確率為74.0%,對(duì)于YXHW證的準(zhǔn)確率為72.5%,對(duì)于QYLX的準(zhǔn)確率為96.7%。該模型對(duì)于肺結(jié)核三證候的分型具有較好的鑒別能力,盲法驗(yàn)證對(duì)于FYX證辨證的準(zhǔn)確率為76.2%,對(duì)于YXHW證的準(zhǔn)確率為70.8%,對(duì)于QYLX的準(zhǔn)確率為80.0%。對(duì)篩選到的蛋白差異峰進(jìn)行了鑒定和抗體芯片的驗(yàn)證,結(jié)果表明9416.7m/z蛋白峰是apolipoprotein C-Ⅲ載脂蛋白C-Ⅲ中的一段多肽。 結(jié)論：(1)篩選歸納了肺結(jié)核各證候特有的差異蛋白峰,可能是證候外在表現(xiàn)的內(nèi)在病理機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ),為整體性評(píng)價(jià)肺結(jié)核中醫(yī)證候的實(shí)質(zhì)提供證據(jù)；歸納了7個(gè)蛋白峰在三證間的含量呈肺陰虛→陰虛火旺→氣陰兩虛逐漸降低變化,結(jié)果與中醫(yī)理論關(guān)于肺結(jié)核證候病情演變相契合,差異的標(biāo)志蛋白峰體現(xiàn)了肺結(jié)核證候間一定的相互關(guān)系及演變規(guī)律。(2)構(gòu)建了肺結(jié)核中醫(yī)證候蛋白辨證模型,為肺結(jié)核證候診斷的客觀化提供蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn),有助于規(guī)范肺結(jié)核中醫(yī)治療的辨證施治。(3)鑒定和驗(yàn)證了載脂蛋白C-Ⅲ在肺結(jié)核三證候中差異表達(dá),可能為肺結(jié)核中醫(yī)證候分型的血清潛在標(biāo)志物之一,可在臨床和功能方面作進(jìn)一步的驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R521;Q51

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2531023