【摘要】：研究背景氣道粘液高分泌（airway mucushypersecretion）是慢性氣道炎癥性疾病的重要病理生理特征之一，也是目前呼吸系統(tǒng)疾病亟待解決的主要問(wèn)題之一。由于目前粘液高分泌相關(guān)性疾病的普遍性和危重性，人們逐漸開(kāi)始關(guān)注MUC，即粘蛋白。目前，已發(fā)現(xiàn)了21種粘蛋白，其中至少有12種在氣道中表達(dá)。在病理狀態(tài)下，氣道粘蛋白的改變主要表現(xiàn)為由杯狀細(xì)胞分泌的MUC5AC增加。許多粘液高分泌疾病，如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾�。–OPD）、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化（CF）等疾病的病理生理改變與MUC5AC的表達(dá)升高密切相關(guān)，所以研究粘蛋白MUC5AC表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尤為重要。 AGR2(human anterior gradient-2，HAG-2或Gob-4)，是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族（PDIs）的成員之一，是一個(gè)在人組織中廣泛表達(dá)但功能尚不清楚的小分子分泌型蛋白。MUC2是腸道粘液的主要成分，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)AGR2與腸道粘液合成密切相關(guān)，其對(duì)腸道粘液產(chǎn)生是必不可少的。MUC5AC是氣道粘液中最主要的組成部分，我們?cè)O(shè)想AGR2與氣道粘液分泌也存在密切關(guān)系，所以我們采用NIC-H292細(xì)胞，給予CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)氣道粘蛋白MUC5ACmRNA及蛋白的表達(dá)情況，探討AGR2對(duì)人氣道上皮MUC5ACmRNA和MUC5AC蛋白表達(dá)的影響。研究目的觀察CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人氣道粘液上皮NCI-H292細(xì)胞后AGR2mRNA和MUC5ACmRNA的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)粘蛋白MUC5AC的表達(dá)，探討AGR2對(duì)人氣道上皮MUC5ACmRNA和MUC5AC蛋白表達(dá)的影響。 研究方法體外培養(yǎng)人氣道粘液上皮癌細(xì)胞系NCI-H292細(xì)胞，予以不同濃度的CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H292細(xì)胞24h后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)不同濃度的CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況，即AGR2蛋白表達(dá)情況。選擇最佳濃度的CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H292細(xì)胞，設(shè)為轉(zhuǎn)染組，沒(méi)有用CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NCI-H292細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PT-PCR）技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞AGR2mRNA和MUC5AC mRNA的表達(dá)情況；免疫細(xì)胞化學(xué)SP染色法觀察兩組細(xì)胞MUC5AC蛋白的表達(dá)情況。 研究結(jié)果 1.CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H292細(xì)胞的最佳濃度為1.33μg/ml，設(shè)此濃度的CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H292細(xì)胞為轉(zhuǎn)染組。 2.CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H292細(xì)胞后AGR2mRNA和MUC5ACmRNA表達(dá)水平的變化： 2.1RT-PCR結(jié)果顯示，CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H292細(xì)胞后AGR2mRNA表達(dá)陽(yáng)性（0.61±0.05），而對(duì)照組未出現(xiàn)AGR2mRNA的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。 2.2RT-PCR結(jié)果顯示，CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H292細(xì)胞后MUC5ACmRNA表達(dá)量（0.85±0.09）較對(duì)照組（0.35±0.04）明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。 3.CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H292細(xì)胞后MUC5AC蛋白水平變化：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MUC5AC蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位在細(xì)胞漿中，細(xì)胞的胞漿染色呈黃色或黃褐色；對(duì)照組僅有少數(shù)細(xì)胞胞漿著色，CMV-Sport6-AGR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H292細(xì)胞后MUC5AC染色明顯增強(qiáng)呈陽(yáng)性。轉(zhuǎn)染組陽(yáng)性細(xì)胞百分率（21.2±5）與對(duì)照組（2.6±0.4）相比有明顯差異，，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。 結(jié)論AGR2可誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞系NCI-H292細(xì)胞MUC5ACmRNA和MUC5AC蛋白過(guò)度表達(dá)，在氣道粘液高分泌中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2530981