【摘要】：目的：矽肺是一種常見的職業(yè)性呼吸系統(tǒng)疾病。在我國,由于工業(yè)的快速發(fā)展而防護(hù)性措施相對(duì)不甚完善,塵肺病的發(fā)病率仍然很高。到2010年底,我國累計(jì)報(bào)告了676,541例塵肺病例,每年新增10,000例左右,其中一半以上是矽肺病。矽塵做為潛在的致纖維化因子,可誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡,并激活巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥,釋放大量酶和細(xì)胞因子,如轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)。 TGF-β能通過促進(jìn)膠原合成和其他致纖維化因子表達(dá)的上調(diào),以及抑制基質(zhì)降解來促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。作為致纖維化的重要細(xì)胞因子,TGF-β能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞向特異性表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscle actin, α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞分化,而這一過程受到血清應(yīng)答因子(serum response factor, SRF)的調(diào)控。 N-乙酰基-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,Ac-SDKP)是一種具有抗組織炎癥和抗器官纖維化功能的短肽,可被血管緊張素轉(zhuǎn)換酶特異性水解,使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑能夠上調(diào)血漿中Ac-SDKP的表達(dá)。我們和其他課題組發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP具有抑制器官纖維化(包括心、腎、肺)的功能。前期我們報(bào)道了Ac-SDKP能夠抑制慢性炎癥,下調(diào)TGF-β表達(dá)及其誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成,減輕矽肺大鼠纖維化的程度,具有拮抗矽肺纖維化的作用。 本研究擬探討Ac-SDKP能否通過調(diào)控TGF-β及其受體誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化,進(jìn)而抑制矽肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。并采用比較蛋白組學(xué)技術(shù),篩選出矽肺大鼠肺組織中的特異性差異蛋白以及Ac-SDKP對(duì)這些差異蛋白的調(diào)節(jié)規(guī)律。進(jìn)一步闡明矽肺發(fā)生的相關(guān)機(jī)制,尋找Ac-SDKP抗矽肺纖維化的作用靶點(diǎn),以期為開發(fā)Ac-SDKP作為一種新型的抗器官纖維化的新藥提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：原代培養(yǎng)乳鼠肺成纖維細(xì)胞,并分為：1)對(duì)照組；2) TGF-β1誘導(dǎo)組；3) TGF-β受體阻斷劑組(TGF-β1+LY364947);4) Ac-SDKP干預(yù)組(TGF-β1+Ac-SDKP)。采用支氣管一次性灌注二氧化硅(SiO2)粉塵制作大鼠矽肺模型,動(dòng)物被分為：1)對(duì)照4周組；2)矽肺4周組；3)對(duì)照8周組；4)矽肺8周組；5)Ac-SDKP抗纖維化治療組；6) Ac-SDKP預(yù)防治療組。采用免疫組織化學(xué)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Western blot或Realtime PCR等方法檢測(cè)TGF-β1及其受體、SRF. α-SMA、I型和III型膠原蛋白或mRNA的表達(dá)。 提取肺組織蛋白樣品經(jīng)雙向電泳分離,膠體考馬斯亮藍(lán)染色顯示蛋白點(diǎn)。掃描輸入計(jì)算機(jī),用ImageMaster6.0圖像分析軟件對(duì)凝膠進(jìn)行分析,差異蛋白判定標(biāo)準(zhǔn)為：該蛋白點(diǎn)在兩組間(對(duì)照組4周、8周分別與矽塵4周、8周組比較；Ac-SDKP抗纖維化治療組與矽塵8周組比較; Ac-SDKP預(yù)防治療組與矽塵組8周比較)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),且volume%值上下變化超過30%。將凝膠中的差異蛋白點(diǎn)切出,經(jīng)膠內(nèi)胰蛋白酶解,并行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS)獲得肽質(zhì)量指紋譜并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1Ac-SDKP對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞TGF-β1型受體、II型受體的調(diào)節(jié)作用 TGF-β1能夠顯著上調(diào)肺成纖維細(xì)胞TGF-β1型受體、II型受體的表達(dá),與對(duì)照組相比分別上調(diào)1.84和1.94倍。給予TGF-β1受體阻斷劑LY364947,能夠顯著減弱TGF-β1的誘導(dǎo)效應(yīng)。分別為TGF-β1誘導(dǎo)組的63.59%和70.10%。給予Ac-SDKP干預(yù)處理,能夠顯著減少TGF-βⅠ型受體、II型受體的表達(dá),分別為TGF-β1誘導(dǎo)組的76.83%和84.92%。 2Ac-SDKP對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞SRF和a-SMA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 給予TGF-β1誘導(dǎo)48h后,鏡下可見成纖維細(xì)胞胞體伸展,呈紡錘形,免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見胞體內(nèi)大量平行或交叉排列的a-SMA標(biāo)記的肌絲。給予LY364947和Ac-SDKP干預(yù)后,a-SMA陽性表達(dá)的肌絲結(jié)構(gòu)顯著減少。Western blot結(jié)果顯示,TGF-β1誘導(dǎo)SRF、α-SMA蛋白的表達(dá)上調(diào),分別是對(duì)照組的2.65倍和2.00倍。而給予LY364947和Ac-SDKP干預(yù)處理后,能夠明顯下調(diào)SRF和a-SMA蛋白的表達(dá)。LY364947干預(yù)組SRF和a-SMA蛋白表達(dá)分別為TGF-β1誘導(dǎo)組的65.28%和66.50%。Ac-SDKP干預(yù)組SRF和a-SMA蛋白表達(dá)分別為TGF-β1誘導(dǎo)組的50.57%和68.00%。 Realtime PCR結(jié)果顯示,TGF-β1能夠顯著上調(diào)SRF和a-SMA mRNA的表達(dá)水平。與對(duì)照組比分別上調(diào)了2.63倍和2.93倍。給予LY364947和Ac-SDKP干預(yù)處理后,能夠顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SRF和a-SMA mRNA的表達(dá)。LY364947干預(yù)組SRF和a-SMA mRNA表達(dá)分別為TGF-β1誘導(dǎo)組的61.24%和49.68%。 Ac-SDKP干預(yù)組SRF和a-SMA mRNA表達(dá)分別為TGF-β1誘導(dǎo)組的58.14%和44.30%。 3Ac-SDKP對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞I型、III型膠原表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 TGF-β1能夠顯著增加肺成纖維細(xì)胞I型、III型膠原蛋白和mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組比較,分別上調(diào)了I型和III型膠原蛋白表達(dá)的2.11倍和2.15倍。上調(diào)了I型和III型膠原mRNA表達(dá)的2.11倍和2.15倍。給予TGF-β1受體阻斷劑LY364947和Ac-SDKP干預(yù)處理后,均能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞I型、III型膠原蛋白和mRNA的表達(dá)。LY364947干預(yù)組I型、III型膠原蛋白表達(dá)分別為TGF-β1誘導(dǎo)組的65.40%和52.09%,Ac-SDKP干預(yù)組I型、III型膠原蛋白表達(dá)分別為TGF-β1誘導(dǎo)組的59.71%和62.33%。 4Ac-SDKP對(duì)矽肺大鼠TGF-β1、SRF和a-SMA以及膠原表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 與對(duì)照組比較,矽肺模型組血漿中TGF-β1含量明顯上調(diào),矽肺模型組(4周和8周)肺組織中TGF-β1含量分別是相應(yīng)對(duì)照組(4周和8周)的2.55倍和3.22倍。無論是Ac-SDKP抗纖維化治療組還是預(yù)防治療組,均能有效下調(diào)TGF-β1在血漿中的含量水平。分別為矽肺8周組的58.56%和48.14%。 Western blot結(jié)果顯示,矽肺模型組(4周和8周)肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)分別是相應(yīng)對(duì)照組(4周和8周)的2.09倍和2.62倍,Ac-SDKP干預(yù)治療(包括抗纖維化治療和預(yù)防治療)能有效抑制矽肺大鼠肺內(nèi)TGF-β1蛋白的表達(dá),分別為矽肺8周組的62.26%和38.68%。 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照組中SRF和α-SMA僅在大鼠血管和氣管平滑肌細(xì)胞中陽性表達(dá),而在矽肺大鼠間質(zhì)纖維化區(qū)域和矽結(jié)節(jié)中可見較多的SRF和α-SMA陽性表達(dá)的細(xì)胞,Ac-SDKP干預(yù)治療(包括抗纖維化治療和預(yù)防治療)時(shí),SRF和a-SMA的染色強(qiáng)度和范圍明顯減弱。Wester blot結(jié)果顯示,SRF蛋白在矽肺模型組(4周和8周)中的表達(dá)分別是相應(yīng)對(duì)照組(4周和8周)的2.74倍和3.14倍。a-SMA蛋白在矽肺模型組(4周和8周)中的表達(dá)分別是相應(yīng)對(duì)照組(4周和8周)的3.11倍和3.13倍,Ac-SDKP干預(yù)治療(包括抗纖維化治療和預(yù)防治療)時(shí),能夠下調(diào)SRF蛋白的表達(dá),分別是矽肺模型8周組的54.02%和53.63%。同時(shí)下調(diào)a-SMA蛋白的表達(dá),分別是矽肺模型8周組的66.96%和63.69%。 羥脯氨酸法結(jié)果顯示,與對(duì)照比較,矽肺模型組總膠原含量明顯升高,是相應(yīng)對(duì)照組(4周、8周)的1.60倍、1.57倍。給予Ac-SDKP干預(yù)治療,總膠原含量明顯減少,其中,Ac-SDKP抗纖維化治療組總膠原含量是矽肺模型8周組的84.08%,Ac-SDKP預(yù)防治療組總膠原含量是矽肺模型8周組的81.85%。Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照比較,矽肺模型4周組I型和III型膠原蛋白表達(dá)增加,分別是對(duì)照4周組的1.96倍和2.18倍；矽肺模型8周組I型和III型膠原蛋白表達(dá)增加,分別是對(duì)照8周組的2.43倍、2.69倍。給予Ac-SDKP干預(yù)治療,I型和III型膠原蛋白表達(dá)減少,其中,Ac-SDKP抗纖維化治療組I型和III型膠原蛋白表達(dá)分別是矽肺模型8周組的59.79%和65.15%。Ac-SDKP預(yù)防治療組I型和III型膠原蛋白表達(dá)分別是矽肺模型8周組的55.67%和47.72%。 5Ac-SDKP對(duì)矽肺大鼠肺差異蛋白的調(diào)節(jié)作用 經(jīng)蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出的可溶性差異蛋白點(diǎn)中,與對(duì)照4周組相比,矽肺模型4周組有3個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào),4個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。與對(duì)照8周組相比,矽肺模型8周組2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào),4個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。與矽肺模型8周組相比,Ac-SDKP抗纖維化治療組2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào),2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。Ac-SDKP預(yù)防治療組有1個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。 篩選出的難溶性差異蛋白點(diǎn)中,與對(duì)照4周組相比,矽肺模型4周組有14個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào),7個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。與對(duì)照8周組相比,矽肺模型8周組14個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào),8個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。與矽肺模型8周組相比,Ac-SDKP抗纖維化治療組3個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào),4個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。Ac-SDKP預(yù)防治療組有7個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),8個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。上述蛋白點(diǎn)表達(dá)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1通過體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?Ac-SDKP能夠通過阻抑TGF-β及其受體介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的分化,進(jìn)而抑制膠原的合成與沉積,發(fā)揮了抗矽肺纖維化的作用。 2通過蛋白組學(xué)技術(shù),篩選到與矽肺纖維化形成和Ac-SDKP抗矽肺纖維化作用相關(guān)的差異蛋白(多涉及調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多方面的功能)。為進(jìn)一步闡明矽肺的發(fā)生機(jī)制以及探尋Ac-SDKP抗矽肺纖維化作用的新靶標(biāo)提供了重要的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R135.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2521457