【摘要】：研究背景及目的急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)主要是由胃酸吸入、感染、創(chuàng)傷、脂肪栓塞等引起,感染是最常見原因。不論何種原因所致急性肺損傷,炎癥反應(yīng)都在其病理改變中起了主要作用。雖然,大量的研究試圖闡明急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合癥的發(fā)病機(jī)理,但是,至今仍沒發(fā)現(xiàn)特別有效的治療手段。目前,急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的治療上主要以支持治療、藥物治療和輔助通氣治療為主,臨床上仍然保持著很高的病死率,大約維持在30%～40%,因此迫切需要深入研究其發(fā)病機(jī)制,尋找更加有效的治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)不僅具有低免疫原性、多向分化潛能、誘導(dǎo)免疫耐受、還具有免疫抑制的作用。由于MSCs具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性及良好的可塑性,并且MSCs的利用不涉及倫理爭(zhēng)議,因此,到目前為止MSCs已成為細(xì)胞治療和組織工程的最佳候選細(xì)胞材料。但是,其治療機(jī)制仍然沒有完全清楚。核轉(zhuǎn)錄因子KB(NF-κB)是近年研究較多的一個(gè)促炎因子,其在炎癥發(fā)生及調(diào)節(jié)中起了非常重要的作用。近幾年的文獻(xiàn)報(bào)道,阻斷肺上皮細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路可以減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠的粒細(xì)胞性肺炎癥反應(yīng)和肺水腫程度,是肺炎癥疾病的有效治療方法之一。親環(huán)素A(CyPA)是白細(xì)胞趨化因子,其通過與其受體CD147結(jié)合激活MAPK及核因子KB(NF-κB)通路從而調(diào)節(jié)促炎因子的釋放。目前未發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷中對(duì)NF-κB與CyPA的影響的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在研究間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷的生物學(xué)作用及對(duì)NF-κB與CyPA的影響,以期進(jìn)一步闡明MSCs治療ALI的機(jī)制,為臨床發(fā)現(xiàn)更有效的治療方法提供實(shí)驗(yàn)線索。 目的觀察C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在體外培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞的鑒定、形態(tài)及定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的特點(diǎn)。 方法1取C57BL/6J小鼠雙側(cè)股骨和脛骨骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外全骨髓貼壁篩選法原代培養(yǎng)并傳代。2.取原代的MSCs培養(yǎng)至第7代細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)形態(tài)及特征。3.提取第1、3代細(xì)胞,胰酶消化后計(jì)數(shù),以2×103個(gè)/孔接種于96孔板,每孔加入10μlCell Counting Kit-8(CCK-8)溶液,37℃,飽和濕度為5%CO2,培養(yǎng)箱孵育2h后,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。然后在檢測(cè)后第1、2、3、4、5、6、7天同一時(shí)間作相同檢測(cè)。用吸光度值繪制細(xì)胞增殖曲線。4.第5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的C57小鼠BMSCs制成單細(xì)胞懸液,以2×103/ml濃度接種于6孔板,待細(xì)胞達(dá)60%融合時(shí),分別加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液及成脂誘導(dǎo)劑進(jìn)行體外分化培養(yǎng)。5.第5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的C57小鼠BMSCs制成單細(xì)胞懸液,收集約2×106個(gè)細(xì)胞上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。 結(jié)果1.原代培養(yǎng)的MSCs在24h后開始貼壁,48h后貼壁的MSCs逐漸伸展為不規(guī)則圓形、多角形、梭形、排列不規(guī)則。2.成骨誘導(dǎo)后鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染成橘紅色、成脂誘導(dǎo)后脂肪細(xì)胞里的脂滴呈紅色,其它細(xì)胞則不著色。3.MSCs的生長(zhǎng)曲線呈S型,其生長(zhǎng)周期分別為滯后期,對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期。4.C57小鼠MSCs分化的流式細(xì)胞分析顯示：MSCs誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表面主要有Sca-1、CD34、CD29和CD44標(biāo)記分子、缺乏CD117分子。 結(jié)論1.密度離心結(jié)合貼壁法可以成功培養(yǎng)、分離出C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。2.1×1011L-1的細(xì)胞密度是較為理想的原代全骨髓接種密度,2×108L-1是MSCs較為理想的傳代密度。待MSCs生長(zhǎng)到第3-4天時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%-90%時(shí),培養(yǎng)皿中的細(xì)胞是最佳的傳代時(shí)間。3MSCs能于體外培養(yǎng)大量擴(kuò)增和存活,在增殖多代后仍然可以保持良好的細(xì)胞活性和擴(kuò)增能力,并于一定條件下可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。4MSCs誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表面主要有Sca-1、CD34、CD29、CD44標(biāo)記分子、缺乏CD117分子。 目的首先觀察間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用,然后觀察其對(duì)大鼠氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響。 方法1.90只SD大鼠隨機(jī)分為5組：A組：正常對(duì)照組(n=18)尾靜脈注射等量生理鹽水；B組：內(nèi)毒素組(LPS)(n=18)：經(jīng)尾靜脈注射LPS5mg/kg；C組：高劑量干細(xì)胞組(BMSCH組)(n=18)：經(jīng)尾靜脈注射LPS5mg/kg+BMSC2×106/ml0.5ml；D組：低劑量干細(xì)胞組(BMSCL組)(n=18)：LPS5mg/kg+BMSC1×106/ml0.5ml；干細(xì)胞對(duì)照組(BMSC組)(n=18)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2×106/ml0.5ml。分別于造模后6、24、72小時(shí),處死動(dòng)物收取標(biāo)本,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只(LPS的24小時(shí)組因1只死亡固只處死5只)。2.取右肺上葉用于測(cè)定肺濕重/干重,取右肺下葉組織(約0.5cm2)放入多聚甲醛中固定,用于組織形態(tài)學(xué)觀察。取其余肺組織于生理鹽水中迅速漂洗干凈后,立即放入液氮中冷凍,后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?腹主動(dòng)脈采血立即送血?dú)夥治�。分別測(cè)定肺濕重/干重、肺組織MDA、SOD、MP0、TNF-α和IL-1β。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0軟件包處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不同處理組間資料均數(shù)比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析。各組間同一時(shí)間點(diǎn)之間的比較及組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間的比較采用完全隨機(jī)資料的方差分析(one-way ANOVA法),以P0.05判斷差異有顯著性。在進(jìn)行方差分析前,首先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)。對(duì)方差齊性的資料采用LSD法進(jìn)行多重比較；對(duì)方差不齊的資料采用近似F檢驗(yàn)的Welch法進(jìn)行方差分析,并采用Tambane's T2法進(jìn)行多重比較。 結(jié)果1.病理所見：A、E組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡腔無炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁薄,間質(zhì)血管無擴(kuò)張,支氣管粘膜上皮完整。B組肺泡結(jié)構(gòu)受到廣泛破壞,肺組織水腫及肺間質(zhì)明顯的增寬,肺泡腔內(nèi)有漿液性滲出,可見大量紅細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞,C組為BMSC高劑量組,大部分肺組織及間質(zhì)結(jié)構(gòu)較完整,小部分肺泡間隔稍增寬,可見肺間質(zhì)水腫減輕,有少量紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。D組為BMSC (?)低劑量組,肺泡結(jié)構(gòu)部分被破壞,肺間質(zhì)中度的水腫,肺泡腔內(nèi)有多量滲出的紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。2.W/D：不同處理組間有顯著差異(F=57.741,P=0.000),時(shí)間因素和分組因素交互效應(yīng)顯著(F=3.129,P=0.004)。B組均明顯高于A組；24h和72h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),C、D組低于B組；Pa02比較：B組明顯低于A組,C組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)與B組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.MDA：不同處理組間有顯著差異(F=25.742,P=0.000),時(shí)間因素和分組因素?zé)o顯著交互效應(yīng)(F=0.690,P=0.699)。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)B組MDA明顯高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C、D組明顯低于B,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組和E組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SOD：不同處理組間有顯著差異(F=138.052,P=0.000),時(shí)間因素和分組因素?zé)o顯著交互效應(yīng)(F=0.910,P=0.513)。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)B組低于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C、D組明顯高于B,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；E組和A組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MPO：不同處理組間有顯著差異(F=52.057,P=0.000),時(shí)間因素和分組因素?zé)o顯著交互效應(yīng)(F=1.096,P=0.376)。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)B組明顯高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C、D組明顯低于B,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組和E組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-a和IL-1β：IL-1β不同處理組間有顯著差異(F=151.807,P=0.000),時(shí)間因素和分組因素交互效應(yīng)顯著(F=2.085,P=0.048)。TNF-a不同處理組間有顯著差異(F=134.814,P=0.000),時(shí)間因素和分組因素?zé)o顯著交互效應(yīng)(F=1.394,P=0.213)。TNF-α和IL-1β不同組之間存在顯著差異(F=123.507,P0.001)各組同一時(shí)間點(diǎn)的比較：B組較A組顯著性升高,P0.05；C、D組低于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；E組與A組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論1.間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠具有肺保護(hù)作用。2.間充質(zhì)干細(xì)胞移植可以降低急性肺損傷大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥因子的表達(dá)。3.SD大鼠對(duì)小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞移植無明顯的排異反應(yīng),無明顯的毒副作用。 目的1.觀察NF-κB在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織的活性變化及間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)NF-κB活性的影響,探索NF-κB在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷的發(fā)病機(jī)理及間充質(zhì)干細(xì)胞治療機(jī)理中的作用。2.觀察CyPA在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織表達(dá)的變化及間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)CyPA表達(dá)的影響,探索CyPA在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷的發(fā)病機(jī)理及間充質(zhì)干細(xì)胞治療機(jī)理中的作用。 方法1.間充質(zhì)干細(xì)胞的制備：同第一部分。2.肺組織NF-κB及CyPA的Western blot:a、配制SDS-PSGE電泳膠。b、處理樣品：依次取樣(上樣量為10ug)加入到20ul2×SDS凝膠加樣緩沖液中,沸水中煮沸8分鐘使蛋白變性,然后10000rpm離心5分鐘。c、上樣：先將梳子小心的移出,把凝膠固定在電泳裝置上,內(nèi)外槽各加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液,取樣品用加樣器向孔內(nèi)加入樣品,加樣量通常在1020ul,將電泳裝置與電源連接,接通電源凝膠上膠電壓為60伏,當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后(跑平即可),把電壓提高到120伏。繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約0.5cm,然后關(guān)閉電源,從電泳裝置上卸下玻璃板,用刮勺撬開玻璃板,在凝膠上部一角處切去一角標(biāo)注加樣順序。d、免疫印跡(Western Blot):(?)將電泳結(jié)束后的膠片放入轉(zhuǎn)印緩沖液中,將轉(zhuǎn)印膜也放入轉(zhuǎn)印緩沖液中浸潤(rùn),進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,膜在正極,膠在負(fù)極,分別用濾紙3張/面壓住膠和膜。轉(zhuǎn)移時(shí)電壓100伏,轉(zhuǎn)移時(shí)間1小時(shí),電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱,固應(yīng)在轉(zhuǎn)移裝置的外面加入冰塊進(jìn)行除熱,轉(zhuǎn)移結(jié)束后,卸下電泳裝置,把硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜放入盛有10%脫脂奶粉或10%BSA的封閉液中,封閉2小時(shí)或過夜,封閉完畢后用PBST洗膜5次,每次間隔5分鐘,加一抗。反應(yīng)1小時(shí),洗膜5次每次間隔5分鐘。(一抗HPS701：200)(一抗HSV11：200),加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,按說明書要求的稀釋比例加入,反應(yīng)1小時(shí)。洗膜5次每次間隔5分鐘。(二抗1：1000),取ECL熒光底物(Pierce公司,貨號(hào)：37071)A液和B液1各mL,混勻后,將PVDF膜浸泡其中,室溫孵育3-5分鐘后,用濾紙將PVDF膜表面液體擦干,并將其置于暗室,取醫(yī)用X光底片覆蓋,曝光1分鐘后,依次顯影、定影即可。3CyPA的RNA提取和Real-PCR:a、抽提RNA。b、反轉(zhuǎn)錄：融解反應(yīng)所需的試劑,上下輕微顛倒混勻,進(jìn)行短暫離心后放置冰上待用,然后配制RT反應(yīng)液(所有反應(yīng)都在冰上進(jìn)行操作),混勻反應(yīng)Mix,短暫離心后37-C孵育30小時(shí),反應(yīng)結(jié)束后,85℃滅活處理5min,對(duì)所得到的cDNA用滅菌水稀釋5倍后做好標(biāo)記并-20℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。c、定量PCR實(shí)驗(yàn)：通過引物驗(yàn)證預(yù)實(shí)驗(yàn)確定選取特異性擴(kuò)增,無引物二聚體、靈敏度高的引物為下游各基因表達(dá)量差異分析的使用引物,將All-in-One qPCRMix在室溫下融解,輕柔得上下顛倒混勻并進(jìn)行短暫離心,同時(shí)在使用過程中始終保持避光,制備PCR reaction mix(在冰上操作),PCR reaction mix制備后,迅速將稍混勻,并加入96孔板中。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0軟件包處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不同處理組間資料均數(shù)比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析。各組間同一時(shí)間點(diǎn)之間的比較及組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間的比較采用完全隨機(jī)資料的方差分析(one-way ANOVA法),以P0.05判斷差異有顯著性。在進(jìn)行方差分析前,首先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)。對(duì)方差齊性的資料采用LSD法進(jìn)行多重比較；對(duì)方差不齊的資料采用近似F檢驗(yàn)的Welch法進(jìn)行方差分析,并采用Tambane's T2法進(jìn)行多重比較。 結(jié)果1.本研究通過檢測(cè)核提取物中NF-κBp65的蛋白表達(dá)量來決定NF-κB的活性。不同處理組間有顯著差異(F=681.495,P=0.000),時(shí)間因素和分組因素交互效應(yīng)顯著(F=8.672,P=0.000)。各組NF-κB方差齊性檢驗(yàn)：F=1.769,P=0.150,方差齊性。各組之間多重比較選用LSD法。方差分析(ANOVA)結(jié)果：F=185.399P=0.000,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組同一時(shí)間點(diǎn)的比較：三組NF-κB的核內(nèi)表達(dá)量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間均有顯著性差異(6小時(shí)：F=273.165,P0.001：24小時(shí)：F=179.975,P0.001；72小時(shí)：F=254.031,P0.001=,以B組最、高C組其次、A組最低,且同一時(shí)間點(diǎn)各組之間兩兩比較也均有顯著性差異(P0.05)。2.肺組織CyPA蛋白表達(dá)(Western blot)水平的變化：不同處理組間有顯著差異(F=984.853,P=0.000),時(shí)間因素和分組因素交互效應(yīng)顯著(F=16.884,P=0.000)。各組CyPA方差齊性檢驗(yàn)：F=1.865,P=0.130,方差齊性。各組之間多重比較選用LSD法。方差分析(ANOVA)結(jié)果：F=278.073P=0.000,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組同一時(shí)間點(diǎn)的方差分析：三組CyPA的表達(dá)量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間均有顯著性差異(6小時(shí)：F=278.01,P0.001：24小時(shí)：F=436.923,P0.001；72小時(shí)：F=412.712,P0.001),以B組最、高C組其次、A組最低,且同一時(shí)間點(diǎn)各組之間兩兩比較也均有顯著性差異(P0.05)。3.肺組織CyPA mRNA轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)水平的變化：不同處理組間有顯著差異(F=53.680,P=0.000),時(shí)間因素和分組因素?zé)o顯著交互效應(yīng)(F=0.015,P=1.000)。各組CyPA方差齊性檢驗(yàn)：F=2.199,P=0.046,方差不齊。各組之間多重比較選用Tambane's T2法。方差分析選用近似F檢驗(yàn)的Welch法,方差分析結(jié)果：F=11.964P=0.000,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組同一時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較：三組CyPA轉(zhuǎn)錄水平各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間均有顯著性差異(6小時(shí)：F=18.445,P0.001：24小時(shí)：F=15.117,P0.001；72小時(shí)：F=20.820,P0.001),以B組最、高C組其次、A組最低,且同一時(shí)間點(diǎn)各組之間兩兩比較也均有顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論1.親環(huán)素A和NF-κB在尾靜脈注射內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的肺組織中表達(dá)升高。2.注射內(nèi)毒素后立即經(jīng)尾靜脈注射小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞顯著降低急性肺損傷大鼠的肺組織中的親環(huán)素A和NF-κB的表達(dá)。3.親環(huán)素A和NF-κB在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷的發(fā)病中起到重要作用,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過抑制NF-κB的活性和抑制親環(huán)素A的表達(dá)而起到治療作用。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2473137