【摘要】：研究背景及目的:二異氰酸酯類是一類重要的致敏原,被廣泛應(yīng)用于剛性或軟質(zhì)聚氨酯泡沫工業(yè)生產(chǎn)中,作為一種良好的硬化劑也被應(yīng)用于聚氨酯噴涂涂料和粘合劑生產(chǎn)中,是許多工業(yè)化國家中導(dǎo)致職業(yè)性哮喘最常見的原因。甲苯二異氰酸酯(TDI)是其主要類型之一,TDI所導(dǎo)致的職業(yè)性哮喘可產(chǎn)生典型的哮喘病理特征,主要包括:氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥,氣道炎癥主要與淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤相關(guān)。然而針對其所導(dǎo)致的哮喘炎癥機(jī)制研究仍然十分匱乏。胸腺基質(zhì)淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)是一種類白介素(IL-)7細(xì)胞因子。TSLP主要表達(dá)于上皮細(xì)胞和皮膚角質(zhì)細(xì)胞。近來研究表明,其他細(xì)胞類型如肥大細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞以及腫瘤或腫瘤相關(guān)細(xì)胞均可以表達(dá)TSLP。在受到各種內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激時(shí),TSLP表達(dá)增多,并與機(jī)體紊亂或維持穩(wěn)態(tài)相關(guān)。如氣道受到外界過敏原如屋塵螨或病原體刺激時(shí)會分泌大量的TSLP,進(jìn)而作用于樹突狀細(xì)胞,上調(diào)OX40配體,促進(jìn)炎癥因子IL-4,IL-5,IL-13和TNF-y表達(dá)及釋放,而反過來,高水平IgE和Th2相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-4,IL-13,IL-25和IL-33)又可以促進(jìn)TSLP的表達(dá),從而形成正反饋,不斷放大氣道Th2炎癥,促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明在卵清蛋白(OVA)哮喘小鼠模型中敲除TSLP受體后,氣道炎癥明顯改善。而予以肺部過表達(dá)TSLP后,再予過敏原刺激,小鼠可出現(xiàn)明顯的氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥、粘液高分泌及氣道重塑。在臨床哮喘患者中,TSLP表達(dá)明顯升高,并與氣道炎癥及氣道阻塞呈正相關(guān),而予以TSLP單克隆抗體治療后可明顯改善哮喘患者臨床癥狀。因此,TSLP與哮喘的發(fā)病更是息息相關(guān)。然而,最新研究表明,人TSLP具有兩種亞型,即長鏈TSLP(long TSLP,1TSLP)和短鏈TSLP(shortTSLP,shTSLP),他們結(jié)構(gòu)相似,作用卻完全不同。Long TSLP即全長TSLP(full-lengthTSLP),其分子量大小為25KDa,既往絕大多數(shù)關(guān)TSLP的研究主要指long TSLP,最早發(fā)現(xiàn)TSLP亞型區(qū)別的是日本的一位學(xué)者Harada M,他首次報(bào)道了當(dāng)人氣道上皮細(xì)胞系受到poly(I:C)刺激時(shí)會促進(jìn)long TSLP表達(dá),而不是short TSLP,因此提示了 long TSLP才是導(dǎo)致Th2炎癥的關(guān)鍵因子,與short TSLP的作用可能具有差異性。而最近有關(guān)TSLP亞型的研究進(jìn)一步明確了他們的差異性,在小鼠腸炎模型中,short TSLP治療后可明顯改善小鼠體重減輕并更快恢復(fù),表明short TSLP可以保護(hù)腸炎。而且,short TSLP在體外亦可以抑制細(xì)菌的生長,發(fā)揮抗菌活性。而本課題組最新研究亦表明在屋塵螨哮喘動物模型中short TSLP亦發(fā)揮了一定的抗炎及氣道屏障保護(hù)作用。那么,基于TSLP亞型的作用差異性,尤其是short TSLP的抗炎作用,大大提高了我們對TSLP的認(rèn)識,目前有關(guān)short TSLP在哮喘中的作用仍少見報(bào)道,我們有必要進(jìn)一步探討short TSLP對哮喘氣道炎癥的影響及其可能的作用機(jī)制。本研究第一個(gè)目的,應(yīng)用TDI哮喘小鼠模型,予以short TSLP多肽處理后,觀察其對氣道炎癥的影響。氣道上皮細(xì)胞作為氣道與外界環(huán)境的第一道防線,不僅發(fā)揮著物理屏障的作用,更是一道免疫屏障,當(dāng)氣道上皮受到外界各種過敏原和病原體刺激時(shí),會分泌大量的炎癥介質(zhì),如IL-25、IL-33、TSLP、HMGB1等,進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及啟動哮喘氣道炎癥的作用。本課題組前期研究中已經(jīng)證明,高遷移率族蛋白1(HMGB1)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)軸在TDI哮喘氣道炎癥中發(fā)揮了重要作用,并可以激活PI3K/Akt信號通路,因此本研究的第二個(gè)目的,在體外合成TDI-HSA復(fù)合物并刺激人氣道上皮細(xì)胞系16HBE細(xì)胞,觀察其對HMGB1-RAGE軸信號及TSLP亞型表達(dá)的影響,以及short TSLP在其中的作用。方法1動物實(shí)驗(yàn)1.1建立TDI哮喘小鼠模型,分別通過氣管內(nèi)給藥和腹腔注射給藥方式在每次激發(fā)前30min予以short TSLP處理小鼠1.2檢測小鼠氣道高反應(yīng)性1.3動物標(biāo)本檢測:取血并檢測血清總IgE水平,小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)并檢測淋巴上清中Th1相關(guān)炎癥介質(zhì)IFN-y及Th2相關(guān)炎癥介質(zhì)IL-4,IL-5,IL-13分泌水平,支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞分類計(jì)數(shù),小鼠肺組織病理染色,肺組織HMGB1,RAGE,TSLP及信號分子p-STAT3、p-STAT5的免疫組化及蛋白免疫印記。2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2.1體外培養(yǎng)正常人氣道上皮細(xì)胞系16HBE細(xì)胞,分別用TDI-HSA和rhHMGB1處理細(xì)胞,并予以short TSLP進(jìn)行預(yù)處理。2.2蛋白印記及實(shí)時(shí)定量PCR檢測16HBE細(xì)胞HMGB1,RAGE,1TSLP及多種信號通路蛋白及1TSLP和shTSLP mRNA的表達(dá)2.3細(xì)胞免疫熒光雙染技術(shù)檢測HMGB1-RAGE在細(xì)胞中的表達(dá)分布情況3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間總體均數(shù)比較采用單因素方差分析,方差齊時(shí)采用Bonferonni方法,方差不齊時(shí)用Dunnett's T3方法,以p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1動物實(shí)驗(yàn)1.1 TDI組小鼠氣道反應(yīng)性明顯增高,而short TSLP治療后明顯改善氣道高反應(yīng)性,并且抑制TDI小鼠血清總IgE水平,減少TDI哮喘小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1相關(guān)炎癥介質(zhì)IFN-γ及Th2相關(guān)炎癥介質(zhì)IL-4,IL-5,IL-13釋放,BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果示:TDI組嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯增多,而予short TSLP治療后明顯減少。肺組織病理結(jié)果示:TDI組小鼠氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤明顯,氣道上皮增厚,呈增生改變,而short TSLP治療組其炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少,氣道增生不明顯。1.2 TDI小鼠肺組織HMGB1、RAGE、TSLP及p-STAT5表達(dá)明顯增多,而予以short TSLP治療后明顯減少。2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2.1TDI-HSA和rhHMGB1均可促進(jìn)RAGE和long TSLP表達(dá)及信號分子STAT5(Y694)、Akt(S473)和 p38 MAPK(T180/Y182)的磷酸化。2.2 short TSLP 可抑制 RAGE 和 long TSLP 蛋白表達(dá)及 Akt(S473)、p38 MAPK(T180/Y182)和 STAT5(Y694)磷酸化。2.3 short TSLP抑制TDI所誘導(dǎo)的HMGB1核漿轉(zhuǎn)位及HMGB1-RAGE共定位。結(jié)論short TSLP可明顯改善TDI哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥,其機(jī)制可能與其抑制HMGB1、RAGE和1TSLP的表達(dá)及STAT5(Y694)的磷酸化有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R562.25

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本文編號：2373107