發(fā)布時(shí)間：2018-11-12 07:34

【摘要】：目的:探討大氣細(xì)顆粒物PM2.5水溶成分(water soluble PM2.5 extracts,WSPE)在體外模型中對HBE細(xì)胞的毒性效應(yīng),通過氧化應(yīng)激激活p53-Noxa通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,探索WSPE暴露的可能細(xì)胞毒性機(jī)制及發(fā)病機(jī)制,為進(jìn)一步認(rèn)識河南地區(qū)大氣PM2.5對呼吸系統(tǒng)危害的毒理機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),指導(dǎo)進(jìn)一步基礎(chǔ)研究和臨床干預(yù)。方法:1于2013年9月19日-25日期間,于鄭州市非工業(yè)區(qū)使用大流量采樣器,每天24h連續(xù)采集樣品,把大氣細(xì)顆粒物收集在石英纖維濾膜載體上,運(yùn)用不同的方法分析鄭州市PM2.5的指標(biāo),這些指標(biāo)包括其質(zhì)量濃度和化學(xué)成分。洗脫石英纖維濾膜收集細(xì)顆粒物,提取水溶性成分真空冷凍干燥保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2 HBE細(xì)胞分別用設(shè)定濃度的WSPE染毒液(0、50、100、200、400、800μg/ml)暴露處理12h、24 h和48h,采用MTT法生長實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率,觀察WSPE對HBE細(xì)胞增殖的影響,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的染毒劑量。3用0、50、100、200、400、800μg/ml WSPE染毒液暴露HBE細(xì)胞24h后,進(jìn)行微核實(shí)驗(yàn),觀察WSPE對細(xì)胞的遺傳毒性;進(jìn)行Hochst染色,定型的觀察觀察wspe對細(xì)胞凋亡的影響;進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn),觀察wspe對細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。4采用400mg/lwspe作為染毒劑,將實(shí)驗(yàn)分為十組:(1)空白對照組;(2)wspe組;(3)wspe+nac組;(4)nac組;(5)pft-α+nac組;(6)pft-α組;(7)wspe+noxa-sirna組;(8)noxa-sirna組;(9)wspe+nc-sirna組;(10)nc-sirna組。其中n乙酰半胱氨酸(nac)為活性氧抑制劑,pft-α為p53抑制劑,noxa-rna和nc-rna為sirna,合成并將其用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入hbe細(xì)胞中。5對實(shí)驗(yàn)組hbe細(xì)胞進(jìn)行mtt生長實(shí)驗(yàn),觀察不同條件下細(xì)胞增殖的影響。6對實(shí)驗(yàn)組hbe細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn),觀察不同條件對細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。7westernblot法檢測目的蛋白p53和noxa的表達(dá)情況,以及caspase-3、caspase-9、cyt.c蛋白表達(dá)水平。8各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用spss12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(onewayanova)。獨(dú)立樣本兩兩比較采用lsd法,檢測水準(zhǔn)為α=0.05。結(jié)果:1鄭州市高新區(qū)pm2.5的日均濃度變化范圍為74.95 164.87μg/m3,日均值為122.76±30.01μg/m3。各種化學(xué)成分中碳元素和水溶性離子所占比重最大。2mtt生長實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,12h、24h、48h時(shí)200、400、800mg/l染毒組對細(xì)胞存活率有明顯抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。用nac預(yù)處理細(xì)胞后,檢測細(xì)胞存活率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。用pft-α預(yù)處理后檢測細(xì)胞存活率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3wspe(≥200mg/l)均可使hbe細(xì)胞微核率顯著增高,對細(xì)胞的染色體產(chǎn)生不可逆損傷,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4不同濃度染毒組對hbe細(xì)胞進(jìn)行染毒24h,細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ros)含量隨著染毒濃度的升高而增加,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。用nac預(yù)處理細(xì)胞后,檢測細(xì)胞dcf陽性率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。用PFT-α預(yù)處理后檢測細(xì)胞DCF陽性率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5不同濃度染毒組細(xì)胞凋亡率隨濃度升高而升高,與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。用NAC預(yù)處理細(xì)胞后,檢測細(xì)胞凋亡率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。用PFT-α預(yù)處理后檢測細(xì)胞凋亡率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6 Western blot分析結(jié)果表明,隨著WSPE染毒時(shí)間延長,p53時(shí)間依賴性表達(dá)并下調(diào)Noxa。在WSPE染毒細(xì)胞中通過應(yīng)用PFT-α、NAC凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9和Cyt.c顯著變化變化。同時(shí)和NC-siRNA組相比,缺失Noxa直接減少WSPE誘導(dǎo)的caspase-3和caspase-9表達(dá),Cyt.c釋放也受到抑制。結(jié)論:WSPE可以減低HBE細(xì)胞的存活率,導(dǎo)致染色體損傷,通過p53-Noxa通路介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R56

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本文編號：2326481