【摘要】：研究目的:慢性堵塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)是一種無(wú)法治愈的、漸進(jìn)性的肺部疾病,這表現(xiàn)在大氣道(慢性氣管炎),小氣道和肺泡(肺氣腫)。暴露于香煙煙霧是罹患COPD的主要危險(xiǎn)因素。慢性支氣管炎與慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及過(guò)度的氣道粘液分泌有關(guān)。對(duì)于吸煙者和COPD患者而言,這種過(guò)剩的粘液分泌是產(chǎn)生咳嗽和呼吸困難等癥狀的重要原因。粘液由在大氣道中的杯狀細(xì)胞產(chǎn)生,而長(zhǎng)期暴露于香煙煙霧會(huì)導(dǎo)致杯狀細(xì)胞數(shù)量增加,粘液分泌增多。在上皮細(xì)胞中存在若干信號(hào)通路與促進(jìn)杯狀細(xì)胞分化及粘液產(chǎn)生有關(guān)。格羅寧根哮喘和COPD研究中心對(duì)吸煙者的研究表明,無(wú)肺部疾病的吸煙者及患有COPD同時(shí)伴有咳嗽和過(guò)多粘液分泌癥狀的吸煙者體內(nèi),多種基因在其上皮細(xì)胞中具有較高的表達(dá)水平。其中一個(gè)很重要的基因是SPDEF,該基因是這整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。已有研究結(jié)果表明,SPDEF可以促進(jìn)杯狀細(xì)胞的分化以及粘液的產(chǎn)生。SPDEF蛋白的表達(dá)可以被表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控,“開(kāi)啟”或“關(guān)閉”該基因的表達(dá)。本論文的研究總體目標(biāo)主要包括以下幾方面:1)研究與COPD患者肺組織中粘液細(xì)胞數(shù)量增加和粘液過(guò)度分泌相關(guān)的表觀遺傳學(xué)變化;2)通過(guò)改變病人的表觀遺傳學(xué)特征(“表觀遺傳學(xué)編輯”),以減少COPD患者肺組織中粘液的產(chǎn)生與分泌。研究方法:本課題分為兩個(gè)部分展開(kāi)研究。第一部分:(1)通過(guò)從COPD患者和對(duì)照組的氣道中分別分離原代上皮細(xì)胞,利用氣液界面(Air-Liquid interface,ALI)培養(yǎng)模式建立體外杯狀細(xì)胞和纖毛上皮細(xì)胞分化模型,并且添加白介素13(IL-13)可以促進(jìn)杯狀細(xì)胞的分化;(2)在培養(yǎng)過(guò)程中利用Realtime PCR監(jiān)測(cè)與粘液分泌相關(guān)的基因的表達(dá):轉(zhuǎn)錄因子SPDEF和FOXA2,粘液的主要成分之一粘蛋白MUC5AC,粘蛋白包裝所需的潛在分子伴侶AGR2;(3)利用焦磷酸化測(cè)序檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子SPDEF和FOXA2基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的DNA的甲基化,分析杯狀細(xì)胞的分化是否伴隨著SPDEF和FOXA2基因的DNA甲基化的變化;(4)在沒(méi)有添加IL-13的培養(yǎng)系統(tǒng)中,比較分析了來(lái)源于COPD個(gè)體和對(duì)照組個(gè)體的上皮細(xì)胞分化至第14天時(shí)相關(guān)基因的表達(dá)水平和甲基化水平,分析COPD患者肺組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量增加和粘液過(guò)度分泌與SPDEF和FOXA2基因的DNA甲基化的調(diào)控的相關(guān)性。第二部分:(1)通過(guò)比較在不同人肺細(xì)胞系中SPDEF和MUC5AC基因的表達(dá),以及SPDEF基因的DNA的甲基化,選擇在與COPD原代細(xì)胞具有類似的SPDEF和MUC5AC基因的高表達(dá)的A549人肺細(xì)胞系中開(kāi)展相關(guān)的研究工作;(2)設(shè)計(jì)可以特異性識(shí)別SPDEF啟動(dòng)子區(qū)域的鋅指結(jié)構(gòu)或引導(dǎo)RNA,利用鋅指結(jié)構(gòu)或CRISPR/d Cas9系統(tǒng),與抑制因子(KRAB,DNA/組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶)的協(xié)同作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)SPDEF基因表達(dá)的表觀調(diào)控(表觀編輯);(3)通過(guò)對(duì)SPDEF基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)下游通路中和粘液有關(guān)的MUC5AC和AGR2等基因的負(fù)調(diào)控;(4)通過(guò)對(duì)多個(gè)不相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè),研究靶向SPDEF基因的表觀編輯的特異性;(5)通過(guò)多次細(xì)胞傳代,研究表觀編輯對(duì)SPDEF基因表達(dá)調(diào)控的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。結(jié)果:第一部分:(1)在添加有白介素13(IL-13)的對(duì)照組上皮細(xì)胞的分化過(guò)程中,伴隨著與黏液產(chǎn)生相關(guān)的基因如MUC5AC,AGR2和SPDEF表達(dá)的增加,以及與抑制黏液產(chǎn)生有關(guān)的基因FOXA2的表達(dá)水平的降低;(2)在分化過(guò)程中SPDEF基因表達(dá)的增加與SPDEF的DNA甲基化的改變之間存在正相關(guān)關(guān)系;(3)與對(duì)照組相比,來(lái)自COPD個(gè)體的上皮細(xì)胞中SPDEF和MUC5AC基因具有較高的表達(dá)水平,并且與SPDEF基因的較低的DNA甲基化水平有關(guān)。第二部分:(1)所有靶向SPDEF的抑制性融合蛋白都能有效的抑制SPDEF信使RNA和蛋白的表達(dá),并且伴隨有和粘液有關(guān)的MUC5AC和AGR2等基因的負(fù)調(diào)控;(2)有別于G9A的酶活性突變體或其他融合蛋白,組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9A的對(duì)SPDEF的抑制作用不受細(xì)胞有絲分裂的影響,具有一定的穩(wěn)定性。結(jié)論:(1)我們發(fā)現(xiàn)在來(lái)自COPD患者的氣道上皮細(xì)胞中,SPDEF基因的DNA甲基化水平和表達(dá)水平都發(fā)生了改變,我們推測(cè)SPDEF基因可能在COPD的發(fā)病機(jī)制中起著十分重要的作用,因此該基因可能是一個(gè)未來(lái)用于表觀遺傳學(xué)編輯和治療COPD的良好靶標(biāo)。(2)由細(xì)胞系的初步研究結(jié)果表明,有針對(duì)性的增加SPDEF基因的DNA/組蛋白甲基化確實(shí)可抑制SPDEF基因的表達(dá)和粘液的產(chǎn)生。這些極具發(fā)展前景的研究成果是通過(guò)改變表觀遺傳學(xué)實(shí)現(xiàn)COPD治療邁開(kāi)的第一步,為調(diào)節(jié)任意靶基因的表達(dá)開(kāi)辟了廣闊的前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R563.9

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本文編號(hào)：2326405