【摘要】：研究背景及目的急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一組由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、誤吸等非心源性因素引起的以進(jìn)行性呼吸困難及頑固性低氧血癥為臨床表現(xiàn)的臨床綜合征,是呼吸科常見(jiàn)的急危重癥,近十年來(lái),其60天死亡率一直高達(dá)25%以上[2]。目前的研究表明其病理生理過(guò)程主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生失控的炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙[3],通透性增加,進(jìn)而出現(xiàn)彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫。在細(xì)胞或組織損傷過(guò)程中,炎癥與氧化應(yīng)激是機(jī)體防御反應(yīng)的重要組成部分,并且相互影響。炎癥反應(yīng)往往伴隨氧自由基的生成,進(jìn)而清除病原微生物,而氧自由基也可作為第二信使調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞作為肺泡上皮細(xì)胞的“干細(xì)胞”,具有增殖和分泌的功能,在肺部炎癥及氧化應(yīng)激過(guò)程中起重要作用,產(chǎn)生大量的促炎因子,如IL-8、TGF-β和TNF-α等[3]促發(fā)“瀑布式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)”。其中,TNF-α是肺部炎癥及氧化應(yīng)激過(guò)程的主要促炎因子,在整個(gè)病理生理過(guò)程中誘導(dǎo)產(chǎn)生具有破壞病原微生物及第二信使功能的活性氧(reactive oxygen species,ROS), ROS進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α的釋放,如此不斷正反饋,進(jìn)而觸發(fā)并放大下游一系列炎癥氧化應(yīng)激反應(yīng),氧化肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu),破壞其細(xì)胞生理功能而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與壞死。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,使用TNF受體-Fc融合蛋白(TNFR-Fc)能有效下調(diào)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激,從而減輕急性肺損傷小鼠的肺組織破壞[5]及細(xì)胞凋亡[6][9]。因此,研究肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)對(duì)繼發(fā)的氧化應(yīng)激損傷的調(diào)控作用,對(duì)于研究ARDS的病理生理學(xué)基礎(chǔ)具有重要指導(dǎo)意義。在肺泡上皮細(xì)胞炎癥氧化應(yīng)激過(guò)程中,NADPH氧化酶(Nox)家族是產(chǎn)生ROS的重要來(lái)源,由Noxl-5及Duox1-2等亞型組成,各亞型的分布具有組織特異性,其中肺泡上皮細(xì)胞主要表達(dá)Noxl,劉珍[8]等人證明在TNF-α刺激下,A549細(xì)胞Noxl基因表達(dá)明顯上調(diào)。所以,在肺泡上皮細(xì)胞研究Nox1基因的表達(dá),對(duì)于進(jìn)一步研究肺泡上皮細(xì)胞炎癥氧化應(yīng)激環(huán)路具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,TNFR-Fc可通過(guò)降低LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中TNF-α濃度,控制TNF-a對(duì)炎癥氧化應(yīng)激的活化作用,并下調(diào)Nox1、Nox2、Nox4及XO等基因表達(dá),減輕組織氧化損傷[9]。TNF-α刺激A549細(xì)胞可成功模擬體外肺泡上皮細(xì)胞炎癥氧化應(yīng)激模型,且沉默NF-κB p65基因可下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及凋亡水平,且進(jìn)一步研究表明,NF-K Bp65可結(jié)合至Nox1啟動(dòng)子片段,說(shuō)明NF-K B p65對(duì)Nox1啟動(dòng)子具有調(diào)控作用。除NF-κB外,是否還有其他轉(zhuǎn)錄因子參與了ARDS過(guò)程中TNF-α對(duì)氧化相關(guān)基因Noxl的調(diào)控,從而啟動(dòng)了炎癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷過(guò)程,目前尚無(wú)明確定論。鑒此,我們從Nox1基因啟動(dòng)表達(dá)的開(kāi)始環(huán)節(jié)——啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,對(duì)Nox1基因的表達(dá)進(jìn)行研究。啟動(dòng)子(promoter)是RNA酶辨認(rèn)、結(jié)合和啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列,控制著基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)強(qiáng)度。對(duì)于真核生物,啟動(dòng)子本身并不直接調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄翻譯,而是通過(guò)與具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白質(zhì)結(jié)合才能調(diào)控下游基因活動(dòng)。故研究與啟動(dòng)子DNA結(jié)合的蛋白質(zhì),是了解目的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的重要切入點(diǎn)。 Lambeth等研究表明Nox1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游4000余堿基的序列中包含IRSE、GAS、kappa B、GATA、C/ERB等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),上述轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Nox1轉(zhuǎn)錄有調(diào)節(jié)作用。因此,在炎癥氧化應(yīng)激細(xì)胞模型上研究Noxl啟動(dòng)子區(qū)的差異結(jié)合蛋白對(duì)研究Nox1通路的活化具有重要意義。目前對(duì)啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的研究方法分為細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外方法。細(xì)胞內(nèi)方法包括酵母單雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)等,是用已知的啟動(dòng)子序列篩選與其結(jié)合的蛋白編碼基因,再通過(guò)生物信息學(xué)確定該蛋白質(zhì),具有可高通量篩選的特點(diǎn),但特異性不高。細(xì)胞外方法包括凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、DNase I足跡試驗(yàn)等,是在體外用已重組構(gòu)建好的蛋白質(zhì)與啟動(dòng)子結(jié)合而驗(yàn)證該蛋白,特異性高,但效率低,操作復(fù)雜。鑒于目前對(duì)啟動(dòng)子結(jié)合蛋白研究方法所存在的問(wèn)題,需要采用高通量及特異性高的方法進(jìn)行Nox1啟動(dòng)子區(qū)差異結(jié)合蛋白的篩選,進(jìn)一步闡明ARDS的病理生理機(jī)制。我們采用了生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)、雙向熒光差異蛋白凝膠電泳和蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù),對(duì)TNF-α刺激A549建立的細(xì)胞炎癥氧化應(yīng)激模型Nox1啟動(dòng)子區(qū)的差異結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選及鑒定,為后續(xù)研究Nox1轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),并對(duì)篩選出的蛋白質(zhì)選擇性進(jìn)行初步的功能研究。研究方法：1.TNF-α刺激A549細(xì)胞Noxl啟動(dòng)子區(qū)差異結(jié)合蛋白的篩選1.1制備生物素標(biāo)記Nox1啟動(dòng)子DNA探針本實(shí)驗(yàn)室保留的PGL3-Basic-Nox1重組質(zhì)粒大腸桿菌菌種擴(kuò)大培養(yǎng)后按說(shuō)明書(shū)提取PGL3-Basic-Nox1重組質(zhì)粒作為模板,生物素標(biāo)記Nox1啟動(dòng)子上游引物5’端,PCR擴(kuò)增末端帶生物素的Noxl啟動(dòng)子探針,PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳,按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說(shuō)明切膠回收Nox1啟動(dòng)子DNA探針。1.2 DNA pull-down實(shí)驗(yàn)將A549細(xì)胞以1.5×106接種于15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿,待貼壁細(xì)胞融合至80%時(shí)更換為無(wú)血清培養(yǎng)基12h后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞給予含TNF-α (10ng/ml)的無(wú)血清培養(yǎng)基、對(duì)照組給予等量無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),刺激1h后收集細(xì)胞沉淀按照胞漿、胞核蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行胞漿胞核蛋白抽提,按EttanTM 2D Quant Kit說(shuō)明書(shū)測(cè)定核蛋白濃度。將兩組核蛋白按Dynabeads(?) kilobase BINDERTM Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA pull-down實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞核蛋白Nox1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合蛋白洗脫。1.3雙向熒光差異蛋白凝膠電泳(差異蛋白DIGE分離)細(xì)胞核蛋白進(jìn)行熒光染料CyDye標(biāo)記,上樣到24cm pH 3-10 NL IPG干膠條,置入EttanTM IPGPhor進(jìn)行第一向電泳后,取出IPG干膠條,平衡液平衡后放置于12.5%的聚丙烯酰胺凝膠上端,低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠封膠后用EttanTM DALT Six電泳儀避光條件下進(jìn)行恒定功率第二向電泳。上述用CyDye染色的凝膠為分析膠。用Typhoon Imager 9400成像儀對(duì)電泳后膠板圖像掃描及成像,通過(guò)ImageQuant TL軟件可以看到Cy2、Cy3以及Cy5的圖像分別為藍(lán)色、綠色及紅色,分別代表內(nèi)標(biāo)蛋白、對(duì)照組Nox1啟動(dòng)子結(jié)合蛋白和刺激組Nox1啟動(dòng)子結(jié)合蛋白,Cy3和Cy5通道圖像疊加后得到Overlay圖像。1.4制備膠的制作、成像及差異蛋白分析、挖膠含有同等量各組樣品蛋白混合后的樣品加樣到制備膠進(jìn)行一向和二向電泳,具體步驟和參數(shù)與分析膠的制備要求相同。電泳結(jié)束后,固定、考馬斯亮藍(lán)G250染色液染色,Image Scanner對(duì)膠圖進(jìn)行掃描,得到制備膠的膠圖。用DeCyder V6.5分析軟件在分析膠中先進(jìn)行膠內(nèi)差異分析,再進(jìn)行膠間差異分析,最后過(guò)濾平均體積差異大于1.5倍的蛋白點(diǎn),對(duì)分析到的差異點(diǎn)在制備膠上匹配到相對(duì)應(yīng)的蛋白點(diǎn),最后利用EttanTM Spot picker全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)進(jìn)行挖膠。2.TNF-α刺激A549細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子差異結(jié)合蛋白的質(zhì)譜分析及生物信息學(xué)分析2.1質(zhì)譜分析將差異蛋白點(diǎn)經(jīng)胰酶消化等多步質(zhì)譜鑒定前樣品處理后,樣品點(diǎn)靶輸入ABI 4800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀中,獲取肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting, PMF),采用MS和MS/MS聯(lián)合模式搜索數(shù)據(jù)庫(kù)Swiss-Prot,搜索物種為人。對(duì)結(jié)果按Mascot得分、匹配的片段數(shù)和覆蓋率等進(jìn)行綜合判定。2.2生物信息學(xué)分析采用WoLF PSORT預(yù)測(cè)軟件及參考Swiss-Prot及NCBI,對(duì)DIGE所篩選出的TNF-α刺激A549細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子差異結(jié)合蛋白進(jìn)行綜合的亞細(xì)胞定位分析預(yù)測(cè)。應(yīng)用String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所鑒定出來(lái)的差異蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)一級(jí)相互作用預(yù)測(cè)。3. CSRP2對(duì)Nox1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的初步研究3.1 pcDNA3-CSRP2-C-HA載體的構(gòu)建體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,提取總RNA, RT-PCR擴(kuò)增CSRP2基因mRNACDS全長(zhǎng)片段,通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建pcDNA3-CSRP2-HA載體。3.2細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)CSRP2細(xì)胞內(nèi)定位A549細(xì)胞以1×105接種于24孔板,待長(zhǎng)至80%融合時(shí)按Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行pcDNA3-CSRP2-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染24h后給TNF-α刺激組以終濃度為lOng/ml的TNF-α培養(yǎng)基500 ul,對(duì)照組加入等量普通培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)1h后進(jìn)行免疫熒光染色,檢測(cè)細(xì)胞免疫熒光。3.3熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)CSRP2對(duì)Nox1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響細(xì)胞培養(yǎng)同步驟3.2,待長(zhǎng)至80%融合時(shí)按Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行pcDNA3-CSRP2-HA質(zhì)粒、PGL3-Basic-Noxl質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建)共轉(zhuǎn)染,同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照；轉(zhuǎn)染24h后給TNF-α刺激組以終濃度為10ng/m 1的TNF-α培養(yǎng)基500 ul,對(duì)照組加入等量普通培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)20h后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果1. TNF-α刺激A549細(xì)胞Noxl啟動(dòng)子差異結(jié)合蛋白的篩選制備膠與分離膠蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配后,通過(guò)軟件分析找到感興趣的差異蛋白點(diǎn)(表達(dá)差異大于1.5倍)共24個(gè),其中上調(diào)點(diǎn)23個(gè),下調(diào)點(diǎn)1個(gè)。2. TNF-a刺激A549細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子差異結(jié)合蛋白的質(zhì)譜鑒定2.1 質(zhì)譜鑒定通過(guò)質(zhì)譜鑒定,從24個(gè)差異蛋白點(diǎn)中鑒定出13種蛋白質(zhì),分別為GLE1、 ALB、EXD2、KRT9、TTC34、KRT10、KRT1、DDX19A、GSTM5、GATC、 SSX11、H4、CSRP2,其中,KRT1和KRT10為同類(lèi)蛋白質(zhì)(角蛋白),膠粒724、725、727、742鑒定結(jié)果為蛋白質(zhì)KRT9,膠粒728、741、745、754鑒定結(jié)果為蛋白質(zhì)KRT10,膠粒1556、1591鑒定結(jié)果為蛋白質(zhì)GSTM5,說(shuō)明這些蛋白質(zhì)在TNF-α刺激后發(fā)生了修飾的改變。2.2蛋白質(zhì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析通過(guò)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè),鑒定出的13種蛋白質(zhì)中,GLE1、EXD2、KRT9、 TTC34、KRT10、KRT1、DDX19A、GATC、Histone H4、CSRP2具有核定位信號(hào)。2.3蛋白質(zhì)一級(jí)相互作用分析通過(guò)軟件分析, KRT1、KRT9、ALB及 Histone H4之間存在相互作用關(guān)系,KRT10與GLE1之間存在相互關(guān)系。3. CSRP2對(duì)Nox1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的初步研究3.1 pcDNA3-CSRP2-C-HA載體的構(gòu)建通過(guò)測(cè)序鑒定, 證明pcDNA3-CSRP2-HA載體構(gòu)建成功。3.2細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)CSRP2細(xì)胞內(nèi)核定位靜息狀態(tài)下,CRP2在胞漿及胞核,但主要在細(xì)胞漿內(nèi)分布,TNF-α刺激1h后,CSRP2濃聚于核膜,部分入核。3.3熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)CSRP2對(duì)Nox1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響經(jīng)單因素方差分析,靜息狀態(tài)下,pcDNA3-CSRP2-C-HA轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著高于pcDNA3-C-HA轉(zhuǎn)染組(F=21.114, P=0.006),經(jīng)析因分析,TNF-α刺激后,熒光素酶活性顯著升高(F=46.189, P=0.000); pcDNA3-CSRP2-HA轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著高于pcDNA3-HA轉(zhuǎn)染組(F=26.868, P=0.000); TNF-α與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種處理因素間有交互效應(yīng)(F=5.447, P=0.042).結(jié)論1. GLE1、ALB、EXD2、KRT9、TTC34、KRT10、KRT1、DDX19A、GSTM5、 GATC、SSX11、H4、CSRP2等13種差異蛋白質(zhì)可能直接／間接參與了]TNF-α誘導(dǎo)的A549細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活化過(guò)程；2.初步證明CSRP2具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性,在TNF-α刺激下發(fā)生核轉(zhuǎn)位,從胞漿進(jìn)入胞核,并參與了Nox1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R563.8

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1 記者　錢(qián)錚;人類(lèi)DNA上啟動(dòng)子數(shù)量可能超過(guò)十九萬(wàn)[N];人民日?qǐng)?bào);2006年

2 錢(qián)錚;人類(lèi)DNA上啟動(dòng)子數(shù)量可能超過(guò)19萬(wàn)個(gè)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

3 ;兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡中白細(xì)胞介素－10啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性對(duì)自身表達(dá)水平的影響[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 馬洪鑫;ZHX2調(diào)控脂蛋白脂酶參與脂肪肝及肝細(xì)胞肝癌的作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

2 宋劍平;基質(zhì)金屬蛋白酶-3基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)與散發(fā)性腦動(dòng)靜脈畸形的遺傳易感性分析與功能研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 田媛;關(guān)于人腦膠質(zhì)瘤中miR-144/451啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

4 王相玲;ICP4促進(jìn)miR-101表達(dá)及miR-101調(diào)節(jié)HSV-1復(fù)制機(jī)制的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

5 呂東梅;蘋(píng)果HMGR基因家族啟動(dòng)子的克隆及功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 楊予濤;一個(gè)光合組織特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆、功能分析及其轉(zhuǎn)錄因子的鑒定[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 楊曉敏;環(huán)加氧酶-2啟動(dòng)子區(qū)抑制性結(jié)合蛋白的鑒定和功能分析[D];南京醫(yī)科大學(xué);2007年

8 柳小慶;玉米胚特異性高表達(dá)啟動(dòng)子的基因組規(guī)模篩選、克隆和功能鑒定[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

9 李哲;釀酒酵母和大腸桿菌的啟動(dòng)子特性及其代謝工程應(yīng)用研究[D];北京理工大學(xué);2015年

10 陸超;人CD2AP基因啟動(dòng)子的鑒定及其功能研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 余霜;家蠶血細(xì)胞特異啟動(dòng)子的篩選與鑒定[D];西南大學(xué);2015年

2 王璇;水曲柳節(jié)律基因LHY啟動(dòng)子克隆及功能研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

3 趙夏云;芥菜開(kāi)花整合子SOC1的啟動(dòng)子克隆及其與FLC、SVP蛋白相互作用[D];西南大學(xué);2015年

4 張?chǎng)纹?擬南芥和油菜花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆與功能分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 于璐;受體相互作用蛋白激酶3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特性研究[D];蘇州大學(xué);2015年

6 李玉姣;豬肝臟特異性TTR基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)扣囊復(fù)膜孢酵母菌BGL1基因在轉(zhuǎn)基因鼠中的表達(dá)驗(yàn)證[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 郭凱慶;反向PCR精確定位人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞CD133基因啟動(dòng)子區(qū)脫氧核糖核酸酶Ⅰ高敏感位點(diǎn)[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

8 楊丹;大豆誘導(dǎo)型NAC轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子克隆及功能研究[D];山東大學(xué);2015年

9 李杰;楊樹(shù)木質(zhì)部特異性啟動(dòng)子的功能及JCesAP關(guān)鍵調(diào)控域研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 汪澤宇;c1orf109結(jié)合cyclin D1啟動(dòng)子序列特征研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：2177516