本文選題：磷酸肌醇3-激酶 + 急性肺損傷��； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：第一部分PI3K抑制劑對急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制 目的：探討磷酸肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinases, PI3K)抑制劑對肉毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所致小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用,并比較不同的給藥方式、給藥劑量、藥物種類以及不同時(shí)間點(diǎn)的療效差別。 方法：取6-8周齡的雄性CD-1小鼠,連續(xù)3天分別經(jīng)鼻(0.5mg/kg)或經(jīng)胃管(50mg/kg)滴入3種不同的P13K抑制齊(?)(LY294002,SHBM009,GDC0941)或PBS,隨后經(jīng)氣道滴入LPS(1.25mg/kg)誘導(dǎo)肺損傷,分別在LPS滴入后4h和24h處死小鼠(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只)。觀察這3種P13K抑制劑對LPS刺激后小鼠肺毛細(xì)血管通透性、肺組織重量/體重比值、肺組織氣體容量(excised lung gas volume, ELGV)、肺泡灌洗液蛋白滲出和炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡灌洗液(Brochoalveolar lavage fluid,BALF)炎癥因子水平的影響,并比較不同給藥方式、不同時(shí)間點(diǎn)的療效差別。A549上皮細(xì)胞分別在含有不同濃度SHBM1009(1或10ug/mL)的培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后用LPS(1ug/ml)或PBS刺激。在刺激后3,6,12,24收集培養(yǎng)液上清,4℃離心10000rpm10min,用ELISA方法測定培養(yǎng)液上清中角質(zhì)細(xì)胞源性趨化因子(KC)、白三烯B4(LTB4)的水平。 結(jié)果：LPS刺激后4h和24h小鼠肺組織重量/體重的比值明顯高于PBS刺激組(P0.01),經(jīng)鼻或經(jīng)胃管滴入LY294002或GDC-0941能抑制肺組織重量/體重比值的升高(P0.05),具有保護(hù)作用。經(jīng)鼻滴入SHBM1009亦具有明顯保護(hù)作用(P0.01)。經(jīng)鼻滴入LY294002或SHBM1009能明顯抑制LPS刺激4h或24h后ELGV的增加(P0.05)。經(jīng)鼻滴入這3種P13K抑制劑均能抑制LPS刺激后4h肺泡灌洗液的白細(xì)胞浸潤(P0.01或0.05)。LPS刺激能明顯增加4h和24h小鼠肺泡灌洗液角質(zhì)細(xì)胞趨化因子(KC)的含量(P0.01),只有SHBM1009經(jīng)鼻滴入4h組顯示出明顯抑制作用(P0.01)。利用伊文思藍(lán)染色證明LPS能增加肺泡毛細(xì)血管通透性(P0.01),而經(jīng)鼻滴入SHBM1009具有明顯保護(hù)作用(P0.05)。通過肺組織免疫熒光染色方法發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼻滴入SHBM1009能抑制LPS所誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞(P0.01)和巨噬細(xì)胞的浸潤(P0.05)。經(jīng)LPS刺激的氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)液上清中KC的水平在3-24h均有明顯升高,而SHBM1009(1ug/ml和10ug/ml)能顯著抑制上皮細(xì)胞分泌KC,且呈劑量依賴性(P值分別為P0.05和P0.01)。LPS刺激后24h,上清液中LTB4和LTB4的水平也有明顯升高。 結(jié)論：P13K抑制劑能預(yù)防LPS所導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷,主要通過保護(hù)毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障、抑制上皮細(xì)胞活化、抑制炎癥細(xì)胞浸潤和黏附能力、減少炎癥因子釋放等。局部給藥的保護(hù)作用優(yōu)于全身給藥,且不同P13K抑制劑的保護(hù)作用也有差異,這可能和藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、靶向部位以及藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)有關(guān)。 第二部分PI3K抑制劑對慢性氣道炎癥、組織損傷和氣道重塑的治療作用 目的：探討P13K抑制劑對胰彈性蛋白酶(pancreatic elastase,PE)所誘導(dǎo)的大鼠慢性氣道炎癥、組織損傷和氣道重塑的治療作用。 方法：取180-200g的健康雄性Wistar大鼠,氣道滴入PE(250IU/kg)誘導(dǎo)肺損傷模型,在隨后的7天或28天內(nèi)經(jīng)鼻滴入PBS、SHBM1009或布地奈德(budesonide, Bud)觀察其治療作用。實(shí)驗(yàn)共分為6組：1)Sham組：PBS刺激+PBS治療；2) Vehicle組：PE刺激+PBS治療；3) SHBM1009對照組：PBS刺激+SHBM1009(10mg/kg);4) SHBM1009(?)(?)劑量組：PE刺激+SHBM1009(1mg/kg);5)SHBM1009高劑量組：PE刺激+SHBM1009(10mg/kg);6) Bud組：PE刺激+Bud (10mg/kg)。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。通過HE染色、電鏡、Masson染色觀察大鼠肺組織病理變化,同時(shí)測定大鼠ELGV、肺組織密度、肺組織重量/體重、BALF蛋白含量和細(xì)胞計(jì)數(shù),ELISA方法檢測肺泡灌洗液炎癥因子IL-1β水平,RT-PCR方法檢測肺組織Fibulin-5的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)部分,A549細(xì)胞以合適密度接種于24孔培養(yǎng)板,以不同濃度PE(0.03U/ml,0.3U/ml,1U/ml,2U/m1)或Vehicle刺激與不同濃度的SHBM1009(0.01umol/L,0.1umol/L,1umol/L,10umol/L)或BEZ235(0.01umol/L,0.1umol/L,1umol/L,10umol/L)共培養(yǎng),Cell-IQ細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)觀察48h內(nèi)細(xì)胞增生、分裂和凋亡情況。 結(jié)果：組織病理學(xué)HE染色可見PE刺激后28天,肺泡壁斷裂,肺泡腔明顯擴(kuò)大,電鏡觀察可發(fā)現(xiàn)肺泡II型上皮細(xì)胞微結(jié)構(gòu)變化、間質(zhì)膠原沉積及成纖維細(xì)胞增生、氣血屏障破壞,Masson染色可見Vehicle治療組膠原含量明顯增多,而SHBM1009或Bud治療能保護(hù)肺組織結(jié)構(gòu)的破壞。Vehicle治療組在7天和28天肺組織重量和ELGV值較Sham組和SHBM1009對照組明顯升高(分別為P0.05和P0.01)。PE刺激能誘導(dǎo)肺組織重量增加,雖SHBM1009(1mg/kg)和Bud (10mg/kg)治療組在第7天和28天肺組織重量較vehicle治療組明顯減輕,但與Sham組相比仍有明顯升高(P0.05or0.01)。在PE刺激后第7天,大鼠肺組織密度明顯升高,第28天時(shí),肺組織密度明顯減輕,SHBM1009或Bud治療具有明顯保護(hù)作用(P0.01)。PE刺激后第7天,Vehicle組肺泡灌洗液蛋白含量明顯增加(P0.01),SHBM1009或Bud治療均具有明顯抑制作用(P0.05orP0.01)。PE刺激后第7天和第28天,BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多(P0.01),SHBM1009或Bud治療均具有明顯抑制作用(P0.05or0.01)。PE刺激能誘導(dǎo)BALF炎癥因子IL-1p水平的升高,SHBM1009或Bud治療均具有明顯抑制作用(P0.05or0.01)。Fibulin-5mRNA的水平在Vehicle組明顯升高,SHBM10091mg/kg或10mg/kg治療組在第28天均顯示出治療作用,Bud治療組在第7天和28天均顯示出治療作用。PE刺激能明顯抑制氣道上皮細(xì)胞的增生和分裂,且呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng),而對細(xì)胞凋亡的影響較小。當(dāng)PE濃度為1U/ml時(shí),BEZ235在濃度0.1-1.0uM或SHBM1009在濃度0.01-10uM具有明顯保護(hù)作用。而當(dāng)PE濃度為0.3U/ml時(shí),BEZ2350.01或0.1uM/ml或SHBM10090.01-1.0uM時(shí)保護(hù)作用較明顯。 結(jié)論：P13K參與了肺損傷的發(fā)生和發(fā)展過程,包括早期的炎癥反應(yīng)、肺水腫,以及后期的組織修復(fù)、氣道重塑和肺氣腫,其機(jī)制主要通過促進(jìn)上皮細(xì)胞的增生分裂,修復(fù)損傷的上皮,并能抑制成纖維母細(xì)胞增生和膠原沉積,從而減輕氣道重塑。P13K抑制劑可能成為慢性氣道疾病的一個(gè)治療的新靶點(diǎn)。 第三部分KGF-2對大鼠原位肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制 目的：探討角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)對大鼠原位肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,及對內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的影響。 方法：健康雄性SD大鼠250g左右,分成6組,每組15只,分組如下:1)Sham組：手術(shù)開胸但不經(jīng)歷缺血-再灌注；3)缺血再灌注(ischemia-reperfusion, IR)組(I/R)：動(dòng)物經(jīng)開胸后,左肺門夾閉60min,再灌注180min；3),4)和5)KGF-2低、中、高劑量治療組：動(dòng)物在手術(shù)前72h氣道滴入KGF-22.5mg/kg,5mg/kg和10mg/kg,之后行缺血再灌注手術(shù)；6)地塞米松(dexamethasone, DXM)組：在缺血再灌注手術(shù)前2h腹腔注射地塞米松5mg/kg。在缺血再灌注損傷前后分別采集血標(biāo)本行血?dú)夥治?動(dòng)物處死后HE染色行肺組織形態(tài)學(xué)測量,計(jì)算肺濕干重比值,收集肺泡灌洗液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白水平檢測,肺組織提取RNA和蛋白進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)分析。體外培養(yǎng)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular endothelial cell, HPMEC)進(jìn)一步探討KGF-2對內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。Cell-IQ. Brdu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測KGF-2對細(xì)胞增殖和凋亡的影響；FITC標(biāo)記白蛋白的通透性及跨膜電阻抗檢測內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能。 結(jié)果：肺組織形態(tài)學(xué)觀察顯示IR組肺組織出血、水腫和炎癥反應(yīng)明顯較Sham組嚴(yán)重,KGF-2和DXM均具有預(yù)防作用,其中KGF-22.5mg/kg和5mg/kg的保護(hù)作用最明顯(P0.01)。IR組肺組織濕/干重比值明顯增大,KGF-22.5mg/kg,5mg/kg和DXM5mg/kg具有保護(hù)作用(P0.05)。缺血再灌注之前,所有組血氧分壓無明顯差別,IR之后,IR組、KGF-210mg/kg組及DXM組血氧分壓均明顯降低(P0.05),而KGF-22.5mg/kg和5mg/kg預(yù)處理顯示出明顯保護(hù)作用(P0.05)。IR之后,大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白水平均明顯增加,KGF-2和DXM均顯示出不同程度的保護(hù)作用(P0.05或P0.01)。RT-PCR檢測顯示KGF-2能促進(jìn)肺泡表面蛋白C (surfactant protein C, SPC)的表達(dá),而對SPA的表達(dá)量無明顯影響。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在無損傷刺激的情況下,KGF-2不促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的過度增殖,但可維持損傷情況下細(xì)胞總數(shù)的穩(wěn)定增長。此外,KGF-2還可保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的正常屏障功能。 結(jié)論：KGF-2預(yù)處理能保護(hù)缺血再灌注所致肺損傷,減輕炎癥反應(yīng)、水腫和出血。其保護(hù)作用機(jī)制可能包括促進(jìn)肺泡表面活性物質(zhì)的表達(dá)、維持氣血屏障的正常結(jié)構(gòu)和功能。
[Abstract]:The protective effect and mechanism of the first part of PI3 inhibitor on acute lung injury

Objective : To investigate the protective effects of phosphoinositide 3 - kinase inhibitor on acute lung injury in mice induced by lipopolysaccharide ( LPS ) .

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本文編號(hào)：1808739