本文選題：支氣管哮喘 + IL-21　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：背景 支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)(bronchial asthma,asthma)是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)病、多發(fā)病之一,對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了很大的威脅。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,全球約有3億哮喘患者,其中每年約有一千五百萬(wàn)人因?yàn)樵摬《鴨适趧?dòng)能力。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國(guó)至少也有1500萬(wàn)到2000萬(wàn)哮喘患者,世界各地支氣管哮喘的發(fā)病率、死亡率都呈逐年增高趨勢(shì),每年造成了異常巨大的經(jīng)濟(jì)損失,哮喘已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。哮喘反復(fù)發(fā)作且病因復(fù)雜,在宿主易感因素與環(huán)境因素相互作用下,以慢性氣道炎癥和氣道重塑為基本病理生理改變的綜合征,是一種可以控制但很難治愈的疾病。研究哮喘的發(fā)病機(jī)理,預(yù)防和控制哮喘變態(tài)反應(yīng)性炎癥的發(fā)生和發(fā)展,受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。 在哮喘氣道炎癥發(fā)展過(guò)程中,CD4+T細(xì)胞群中的初始T細(xì)胞經(jīng)變應(yīng)原誘導(dǎo)激活后成為T(mén)h0細(xì)胞,并繼續(xù)朝Th2細(xì)胞方向分化,生成大量的Th2細(xì)胞,Th2細(xì)胞占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位,可大規(guī)模誘發(fā)下游的IgE和／或非IgE介導(dǎo)的Th2炎癥。哮喘發(fā)病過(guò)程中,炎性細(xì)胞在氣道組織中的浸潤(rùn)、聚集、激活和釋放是其主要特征,在此過(guò)程中細(xì)胞因子發(fā)揮了重要作用。慢性炎癥反復(fù)刺激和上皮結(jié)構(gòu)的破壞可以引起哮喘的氣道重塑。目前,氣道炎癥與氣道重塑作為哮喘的兩個(gè)病理特征逐漸被人們所接受。引起氣道重塑的各種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等在氣道重塑中發(fā)揮作用的機(jī)制尚未完全明確。 白細(xì)胞介素21(interleukin21,IL-21)是2000年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子,屬于Ⅰ型細(xì)胞因子家族,主要是由CD4+Th2細(xì)胞合成和分泌,與IL-2、IL-4和IL-15具有同源性。自從發(fā)現(xiàn)了IL-21以后,關(guān)于它的生物學(xué)功能成為了研究的熱點(diǎn)。IL-21的效應(yīng)是多樣的,主要是由于IL-21的受體分布廣泛。IL-21開(kāi)始時(shí)被認(rèn)為是激活的外周血T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,現(xiàn)在被認(rèn)為可以由一系列分化型CD4+Th細(xì)胞合成,生物學(xué)功能主要是刺激T細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞增殖和分化以及CD40特異性應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞的增殖。IL-21受體(IL-21R)表達(dá)于淋巴造血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明,IL-21在先天性免疫、適應(yīng)性免疫及細(xì)胞內(nèi)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用,與多種自身免疫性疾病及炎性疾病有關(guān),例如類(lèi)風(fēng)關(guān)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化病、炎癥性腸病、過(guò)敏性疾病,對(duì)于這些疾病有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。 IL—21在Th細(xì)胞的分化方面起了關(guān)鍵作用,支氣管哮喘是一種免疫異常導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)性疾病,免疫功能紊亂在哮喘發(fā)病中起十分重要的作用,T細(xì)胞的不同方向的分化決定哮喘疾病是否發(fā)生,Th1/Th2失衡及Th17/Treg失衡理論一直是研究的熱點(diǎn)。Th1/Th2細(xì)胞之間處于相互抑制狀態(tài),正常情況下,Th1/Th2細(xì)胞處于恒定狀態(tài),哮喘患者Th1細(xì)胞功能下降,Th2細(xì)胞功能異常增高。Treg細(xì)胞數(shù)量減少、其抑制炎癥反應(yīng)的功能降低,而Th17細(xì)胞過(guò)度表達(dá)介導(dǎo)氣道炎癥。IL—21是CD4+Th2型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分泌,有人認(rèn)為T(mén)h17細(xì)胞又是IL—21生成的一個(gè)重要來(lái)源,由此推斷IL—21可能參與哮喘疾病的發(fā)病。2009年,Rajshekhar Chatterjee第一次報(bào)道了IL-21基因多態(tài)性與哮喘顯著相關(guān)。 IL-21功能的發(fā)揮依靠其受體的共用γ鏈,主要通過(guò)JAK-STAT途徑傳遞信號(hào)。IL-21R蛋白由538個(gè)氨基酸組成,與IL-2Rβ鏈、IL-4R α鏈和IL-9R有同源性,N端有4個(gè)高度保守的Cys殘基,跨膜區(qū)有"WSXWS"序列,胞漿區(qū)存在經(jīng)典的信號(hào)傳遞亞單位boxl和box2基序,表明該受體具有信號(hào)傳導(dǎo)功能。IL-21與IL-21R結(jié)合時(shí),主要通過(guò)與γ c的偶聯(lián),激活JAK1和JAK3(特別是JAK3),活化的JAK酪氨酸激酶使STAT1和STAT3發(fā)生磷酸化,磷酸化STAT移行到細(xì)胞核內(nèi),起到活化T細(xì)胞核因子(NFAT)的作用,誘導(dǎo)IL-21基因表達(dá)。JAK-STAT途徑參與許多細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而影響Th細(xì)胞分化和Th細(xì)胞免疫偏移,是哮喘發(fā)病重要的信號(hào)通路。哮喘小鼠肺組織IL-21及IL-21R表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立慢性哮喘小鼠動(dòng)物模型,用不同的實(shí)驗(yàn)方法觀(guān)察IL-21、IL-21R、STAT3、P-STAT3在哮喘小鼠肺組織的表達(dá),使用地塞米松及酪氨酸激酶(JAK,janus Kinnase)抑制劑AG490進(jìn)行干預(yù),觀(guān)察IL-21對(duì)哮喘氣道炎癥及氣道重塑的影響,探討IL-21/STAT3信號(hào)通路在哮喘發(fā)病中所起的作用。 研究目的 1、用不同的實(shí)驗(yàn)方法觀(guān)察IL-21、IL-21R在小鼠及哮喘小鼠肺組織中的表達(dá),觀(guān)察IL-21及其受體與氣道炎癥、氣道重塑指標(biāo)的關(guān)系。 2、觀(guān)察STAT3、活化后的STAT3(p-STAT3)在哮喘小鼠的表達(dá)及其與氣道炎癥、氣道重塑的關(guān)系。 3、使用JAK通路抑制劑AG490腹腔注射后觀(guān)察哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑指標(biāo)的變化,觀(guān)察肺組織總STAT3、p-STAT3的表達(dá)變化,觀(guān)察IL-21表達(dá)的變化。 4、使用地塞米松干預(yù)哮喘小鼠后,觀(guān)察對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的改變及對(duì)IL-21/STAT3信號(hào)通路的影響。 研究方法 1、動(dòng)物模型的建立和分組 SPF級(jí)BALB/C雌性小鼠,共44只,隨機(jī)分為4組,分別為對(duì)照組、哮喘組、AG490組、地塞米松組,每組11只。哮喘組于第1天、第14天每只小鼠腹腔注射0.2mL致敏液,致敏液含卵蛋白(OVA, Grade V)10ug,氫氧化鋁凝膠100ug,第21天開(kāi)始,霧化吸入25g/L的OVA溶液30min,每周3次,共8周。對(duì)照組以生理鹽水代替OVA。地塞米松組在每次霧化OVA溶液前0.5h腹腔注射10mg/kg地塞米松溶液。AG490組是于第21天開(kāi)始腹腔注射AG490,按每只小鼠每次450ug,每周3次,連續(xù)8周,每5mgAG490用0.5mL二甲基亞砜(0.05%)、9.5mL雙蒸水充分溶解。 2、IL-21及IL-21R在慢性哮喘小鼠肺組織的表達(dá) 在末次霧化吸入24h后,左肺行肺泡灌洗,收集灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),離斷頸椎處死小鼠。左肺組織放入液氮罐用于提取RNA及總蛋白。右肺組織石蠟包埋切片行HE染色,并用免疫組化染色觀(guān)察IL-21、 IL-21R在小鼠肺組織中的表達(dá),采用熒光定量PCR法檢測(cè)肺組織IL-21mRNA、 IL-21R mRNA的表達(dá),western blot法檢測(cè)IL-21蛋白、IL-21R蛋白的表達(dá)。 3、IL-21及IL-21R與氣道炎癥和氣道重塑的關(guān)系 肺泡灌洗液離心后,取沉渣用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)及計(jì)數(shù),重點(diǎn)觀(guān)察細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)變化：肺組織行HE染色觀(guān)察氣道及肺組織病理學(xué)改變；肺組織石蠟切片HE染色后,用IPP6.0圖像分析軟件分析單位長(zhǎng)度基底膜氣道壁面積(氣道壁厚度,total bronchial wall area/basement membrane perimeter, WAt/Pbm)、單位長(zhǎng)度基底膜的氣道平滑肌面積(平滑肌厚度,the area of the wall occupied by smooth muscle/basement membrane perimeter, WAm/Pbm);分析IL-21、IL-21R與WAt/Pbm、WAm/Pbm指標(biāo)的相關(guān)性。 4、STAT3、p-STAT3在慢性哮喘小鼠肺組織的表達(dá)及使用JAK通路抑制劑AG490干預(yù)后的表達(dá)變化 用western blot及免疫組化方法檢測(cè)小鼠肺組織p-STAT3蛋白表達(dá),用熒光定量PCR檢測(cè)肺組織STAT3的表達(dá)；觀(guān)察哮喘小鼠使用了AG490干預(yù)后p-STAT3的表達(dá)的變化,觀(guān)察小鼠氣道炎癥的改變及氣道重塑指標(biāo)的變化。 5、使用地塞米松藥物干預(yù)后氣道重塑的改變及IL-21、IL-21R、p-STAT3的表達(dá)變化 用IPP6.0圖像分析軟件分析地塞米松干預(yù)組小鼠氣道壁厚度(WAt/Pbm)、平滑肌厚度(WAm/Pbm),免疫組化法及western blot法檢測(cè)地塞米松組IL-21、 IL-21R、p-STAT3蛋白在肺組織中的表達(dá),采用熒光定量PCR法檢測(cè)IL-21mRNA、IL-21RmRNA的表達(dá)。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用x±s表示,經(jīng)SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,多組樣本均數(shù)兩兩比較,方差齊者用Bonferroni檢驗(yàn),方差不齊者用Dunnett's T3法檢驗(yàn)；兩變量的相關(guān)分析采用Bivariate過(guò)程的等級(jí)Pearson相關(guān)法。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果 1、44只小鼠全部存活,OVA致敏激發(fā)后,成功建立了慢性哮喘小鼠模型。對(duì)照組小鼠霧化后無(wú)明顯異常反應(yīng),哮喘組小鼠激發(fā)后,出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、二便失禁等癥狀,用聽(tīng)診器聽(tīng)診可聞及哮鳴音。地塞米松組及AG490組癥狀相似,但程度明顯減輕。肺組織HE染色鏡下所見(jiàn)符合哮喘的病理學(xué)特征,哮喘組小鼠細(xì)支氣管及伴行血管周?chē)罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn),氣道壁和肺組織中可見(jiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管管壁增厚、管腔狹窄,支氣管管腔內(nèi)可見(jiàn)粘液栓。 2、免疫組化法結(jié)果表明哮喘小鼠同對(duì)照組小鼠肺組織均有IL-21、IL-21R的表達(dá),哮喘組的表達(dá)較對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)(P0.05),與western blot檢測(cè)結(jié)果一致；熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果同樣顯示哮喘組小鼠IL-21mRNA、IL-21RmRNA表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)(P0.05)。反應(yīng)哮喘組小鼠氣道重塑指標(biāo)的WAm/Pbm、 WAt/Pbm較對(duì)照組增加(P0.05)。 3、哮喘組、AG490組、地塞米松組小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均較正常對(duì)照組明顯增多(P0.01);地塞米松治療組與哮喘組相比,細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少(P0.01),AG490組上述指標(biāo)較哮喘組也有所下降(P0.05)；地塞米松組肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于A(yíng)G490組(P0.05)。 4、免疫組化及western blot分析顯示對(duì)照組幾乎無(wú)p-STAT3蛋白表達(dá),哮喘組小鼠肺組織p-STAT3蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加(P0.05),AG490組小鼠肺組織p-STAT3蛋白表達(dá)較哮喘組減弱(P0.05)；熒光定量PCR顯示哮喘組、AG490組小鼠肺組織STAT3mRNA較對(duì)照組增加(P0.05),兩組相比,無(wú)明顯差異(P0.05)。 5、地塞米松組小鼠氣道重構(gòu)指標(biāo)WAm/Pbm、WAt/Pbm高于對(duì)照組(P0.05),低于哮喘組(P0.05)。Western blot法檢測(cè)地塞米松組IL-21、IL-21R、 p-STAT3在肺組織中的表達(dá)較哮喘組下降(P0.05)；AG490組小鼠IL-21的表達(dá)較哮喘組下降(P0.05),與地塞米松組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),AG490組小鼠肺組織p-STAT3的表達(dá)與地塞米松組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);AG490組小鼠肺組織STAT3mRNA的含量較對(duì)照增加(P0.05),但與哮喘組小鼠相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 6、相關(guān)性分析結(jié)果：用western blot法測(cè)定IL-21蛋白、IL-21R蛋白、p-STAT3蛋白,結(jié)果表明上述指標(biāo)與小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均呈正相關(guān)(r0.5, p0.01);IL-21、IL-21R、p-STAT3的蛋白表達(dá)量與小鼠氣道重構(gòu)指標(biāo)WAm/Pbm、WAt/Pbm均呈正相關(guān)(r0.5,p0.01)。 研究結(jié)論 IL-21主要通過(guò)JAK-STAT途徑傳遞信號(hào),本實(shí)驗(yàn)首先用不同實(shí)驗(yàn)方法觀(guān)察了IL-21及其受體在正常對(duì)照組及哮喘模型組小鼠肺組織中的表達(dá),觀(guān)察了總STAT3及活化后的形式p-STAT3在小鼠肺組織中的表達(dá),在建立慢性哮喘小鼠動(dòng)物模型基礎(chǔ)上,使用JAK通路抑制劑AG490及地塞米松干預(yù)后觀(guān)察上述指標(biāo)的變化。得出以下結(jié)論： 1、IL-21及其受體在小鼠肺組織中有表達(dá),哮喘小鼠肺組織的表達(dá)較對(duì)照組增高,IL-21在哮喘發(fā)病中是重要的促炎因子,IL-21與受體結(jié)合參與慢性哮喘小鼠發(fā)病,并參與了氣道重塑過(guò)程； 2、STAT3及活化后的STAT3參與了哮喘發(fā)病,可能影響了氣道重塑： 3、哮喘模型經(jīng)AG490作用后STAT3的活化程度降低,氣道炎癥及重塑程度減輕,其療效與地塞米松大致相當(dāng)。 4、IL—21通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路參與了哮喘疾病的發(fā)生,地塞米松下調(diào)了IL-21及其受體的表達(dá),抑制了肺組織STAT3的活化,減輕了氣道炎癥和氣道重塑,IL-21/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能為地塞米松治療哮喘的作用靶點(diǎn)之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 張寒冰;張道宮;解光;欒信庸;潘新良;;AG490對(duì)喉癌細(xì)胞STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制作用[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年12期

2 田紅;王淑娟;董亮;;吸入糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘大鼠氣道重塑的影響[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2012年08期

3 袁雙龍;蔣莉;張曉莉;李舒帆;段宏梅;王曉非;;原發(fā)性干燥綜合癥患者血清IL-21水平及其臨床意義[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2007年02期

4 李開(kāi)艷;熊盛道;朱晶;曹勇;熊維寧;;沙美特羅/氟替卡松對(duì)支氣管哮喘患者血清IL-21與總IgE水平的影響[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2011年08期

，

本文編號(hào)：1769093