發(fā)布時間：2018-04-18 16:10

  本文選題：支氣管哮喘 + IL-21�。� 參考：《南方醫(yī)科大學》2013年博士論文

【摘要】：背景 支氣管哮喘(簡稱哮喘)(bronchial asthma,asthma)是呼吸系統(tǒng)常見病、多發(fā)病之一,對人類健康構成了很大的威脅。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計結果顯示,全球約有3億哮喘患者,其中每年約有一千五百萬人因為該病而喪失勞動能力。據不完全統(tǒng)計,我國至少也有1500萬到2000萬哮喘患者,世界各地支氣管哮喘的發(fā)病率、死亡率都呈逐年增高趨勢,每年造成了異常巨大的經濟損失,哮喘已經成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。哮喘反復發(fā)作且病因復雜,在宿主易感因素與環(huán)境因素相互作用下,以慢性氣道炎癥和氣道重塑為基本病理生理改變的綜合征,是一種可以控制但很難治愈的疾病。研究哮喘的發(fā)病機理,預防和控制哮喘變態(tài)反應性炎癥的發(fā)生和發(fā)展,受到越來越多研究者的關注。 在哮喘氣道炎癥發(fā)展過程中,CD4+T細胞群中的初始T細胞經變應原誘導激活后成為Th0細胞,并繼續(xù)朝Th2細胞方向分化,生成大量的Th2細胞,Th2細胞占據優(yōu)勢地位,可大規(guī)模誘發(fā)下游的IgE和／或非IgE介導的Th2炎癥。哮喘發(fā)病過程中,炎性細胞在氣道組織中的浸潤、聚集、激活和釋放是其主要特征,在此過程中細胞因子發(fā)揮了重要作用。慢性炎癥反復刺激和上皮結構的破壞可以引起哮喘的氣道重塑。目前,氣道炎癥與氣道重塑作為哮喘的兩個病理特征逐漸被人們所接受。引起氣道重塑的各種細胞因子、炎癥介質等在氣道重塑中發(fā)揮作用的機制尚未完全明確。 白細胞介素21(interleukin21,IL-21)是2000年發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子,屬于Ⅰ型細胞因子家族,主要是由CD4+Th2細胞合成和分泌,與IL-2、IL-4和IL-15具有同源性。自從發(fā)現(xiàn)了IL-21以后,關于它的生物學功能成為了研究的熱點。IL-21的效應是多樣的,主要是由于IL-21的受體分布廣泛。IL-21開始時被認為是激活的外周血T細胞分泌的細胞因子,現(xiàn)在被認為可以由一系列分化型CD4+Th細胞合成,生物學功能主要是刺激T細胞增殖、NK細胞增殖和分化以及CD40特異性應答B(yǎng)細胞的增殖。IL-21受體(IL-21R)表達于淋巴造血細胞、成纖維細胞、角質細胞、腸上皮細胞。實驗證明,IL-21在先天性免疫、適應性免疫及細胞內的免疫應答中發(fā)揮重要的作用,與多種自身免疫性疾病及炎性疾病有關,例如類風關、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化病、炎癥性腸病、過敏性疾病,對于這些疾病有重要的免疫調節(jié)作用。 IL—21在Th細胞的分化方面起了關鍵作用,支氣管哮喘是一種免疫異常導致的變態(tài)反應性疾病,免疫功能紊亂在哮喘發(fā)病中起十分重要的作用,T細胞的不同方向的分化決定哮喘疾病是否發(fā)生,Th1/Th2失衡及Th17/Treg失衡理論一直是研究的熱點。Th1/Th2細胞之間處于相互抑制狀態(tài),正常情況下,Th1/Th2細胞處于恒定狀態(tài),哮喘患者Th1細胞功能下降,Th2細胞功能異常增高。Treg細胞數量減少、其抑制炎癥反應的功能降低,而Th17細胞過度表達介導氣道炎癥。IL—21是CD4+Th2型細胞分泌的細胞因子,可以促進Th17細胞的分泌,有人認為Th17細胞又是IL—21生成的一個重要來源,由此推斷IL—21可能參與哮喘疾病的發(fā)病。2009年,Rajshekhar Chatterjee第一次報道了IL-21基因多態(tài)性與哮喘顯著相關。 IL-21功能的發(fā)揮依靠其受體的共用γ鏈,主要通過JAK-STAT途徑傳遞信號。IL-21R蛋白由538個氨基酸組成,與IL-2Rβ鏈、IL-4R α鏈和IL-9R有同源性,N端有4個高度保守的Cys殘基,跨膜區(qū)有"WSXWS"序列,胞漿區(qū)存在經典的信號傳遞亞單位boxl和box2基序,表明該受體具有信號傳導功能。IL-21與IL-21R結合時,主要通過與γ c的偶聯(lián),激活JAK1和JAK3(特別是JAK3),活化的JAK酪氨酸激酶使STAT1和STAT3發(fā)生磷酸化,磷酸化STAT移行到細胞核內,起到活化T細胞核因子(NFAT)的作用,誘導IL-21基因表達。JAK-STAT途徑參與許多細胞因子信號轉導而影響Th細胞分化和Th細胞免疫偏移,是哮喘發(fā)病重要的信號通路。哮喘小鼠肺組織IL-21及IL-21R表達未見報道。本研究建立慢性哮喘小鼠動物模型,用不同的實驗方法觀察IL-21、IL-21R、STAT3、P-STAT3在哮喘小鼠肺組織的表達,使用地塞米松及酪氨酸激酶(JAK,janus Kinnase)抑制劑AG490進行干預,觀察IL-21對哮喘氣道炎癥及氣道重塑的影響,探討IL-21/STAT3信號通路在哮喘發(fā)病中所起的作用。 研究目的 1、用不同的實驗方法觀察IL-21、IL-21R在小鼠及哮喘小鼠肺組織中的表達,觀察IL-21及其受體與氣道炎癥、氣道重塑指標的關系。 2、觀察STAT3、活化后的STAT3(p-STAT3)在哮喘小鼠的表達及其與氣道炎癥、氣道重塑的關系。 3、使用JAK通路抑制劑AG490腹腔注射后觀察哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑指標的變化,觀察肺組織總STAT3、p-STAT3的表達變化,觀察IL-21表達的變化。 4、使用地塞米松干預哮喘小鼠后,觀察對哮喘小鼠氣道炎癥的改變及對IL-21/STAT3信號通路的影響。 研究方法 1、動物模型的建立和分組 SPF級BALB/C雌性小鼠,共44只,隨機分為4組,分別為對照組、哮喘組、AG490組、地塞米松組,每組11只。哮喘組于第1天、第14天每只小鼠腹腔注射0.2mL致敏液,致敏液含卵蛋白(OVA, Grade V)10ug,氫氧化鋁凝膠100ug,第21天開始,霧化吸入25g/L的OVA溶液30min,每周3次,共8周。對照組以生理鹽水代替OVA。地塞米松組在每次霧化OVA溶液前0.5h腹腔注射10mg/kg地塞米松溶液。AG490組是于第21天開始腹腔注射AG490,按每只小鼠每次450ug,每周3次,連續(xù)8周,每5mgAG490用0.5mL二甲基亞砜(0.05%)、9.5mL雙蒸水充分溶解。 2、IL-21及IL-21R在慢性哮喘小鼠肺組織的表達 在末次霧化吸入24h后,左肺行肺泡灌洗,收集灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),離斷頸椎處死小鼠。左肺組織放入液氮罐用于提取RNA及總蛋白。右肺組織石蠟包埋切片行HE染色,并用免疫組化染色觀察IL-21、 IL-21R在小鼠肺組織中的表達,采用熒光定量PCR法檢測肺組織IL-21mRNA、 IL-21R mRNA的表達,western blot法檢測IL-21蛋白、IL-21R蛋白的表達。 3、IL-21及IL-21R與氣道炎癥和氣道重塑的關系 肺泡灌洗液離心后,取沉渣用血細胞計數板進行細胞分類及計數,重點觀察細胞總數及嗜酸性粒細胞數、中性粒細胞計數變化：肺組織行HE染色觀察氣道及肺組織病理學改變；肺組織石蠟切片HE染色后,用IPP6.0圖像分析軟件分析單位長度基底膜氣道壁面積(氣道壁厚度,total bronchial wall area/basement membrane perimeter, WAt/Pbm)、單位長度基底膜的氣道平滑肌面積(平滑肌厚度,the area of the wall occupied by smooth muscle/basement membrane perimeter, WAm/Pbm);分析IL-21、IL-21R與WAt/Pbm、WAm/Pbm指標的相關性。 4、STAT3、p-STAT3在慢性哮喘小鼠肺組織的表達及使用JAK通路抑制劑AG490干預后的表達變化 用western blot及免疫組化方法檢測小鼠肺組織p-STAT3蛋白表達,用熒光定量PCR檢測肺組織STAT3的表達；觀察哮喘小鼠使用了AG490干預后p-STAT3的表達的變化,觀察小鼠氣道炎癥的改變及氣道重塑指標的變化。 5、使用地塞米松藥物干預后氣道重塑的改變及IL-21、IL-21R、p-STAT3的表達變化 用IPP6.0圖像分析軟件分析地塞米松干預組小鼠氣道壁厚度(WAt/Pbm)、平滑肌厚度(WAm/Pbm),免疫組化法及western blot法檢測地塞米松組IL-21、 IL-21R、p-STAT3蛋白在肺組織中的表達,采用熒光定量PCR法檢測IL-21mRNA、IL-21RmRNA的表達。 6、統(tǒng)計學處理 數據用x±s表示,經SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。兩樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,多組樣本均數兩兩比較,方差齊者用Bonferroni檢驗,方差不齊者用Dunnett's T3法檢驗；兩變量的相關分析采用Bivariate過程的等級Pearson相關法。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 研究結果 1、44只小鼠全部存活,OVA致敏激發(fā)后,成功建立了慢性哮喘小鼠模型。對照組小鼠霧化后無明顯異常反應,哮喘組小鼠激發(fā)后,出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、二便失禁等癥狀,用聽診器聽診可聞及哮鳴音。地塞米松組及AG490組癥狀相似,但程度明顯減輕。肺組織HE染色鏡下所見符合哮喘的病理學特征,哮喘組小鼠細支氣管及伴行血管周圍大量炎癥細胞浸潤,氣道壁和肺組織中可見以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤,支氣管管壁增厚、管腔狹窄,支氣管管腔內可見粘液栓。 2、免疫組化法結果表明哮喘小鼠同對照組小鼠肺組織均有IL-21、IL-21R的表達,哮喘組的表達較對照組表達增強(P0.05),與western blot檢測結果一致；熒光定量PCR法檢測結果同樣顯示哮喘組小鼠IL-21mRNA、IL-21RmRNA表達較對照組增強(P0.05)。反應哮喘組小鼠氣道重塑指標的WAm/Pbm、 WAt/Pbm較對照組增加(P0.05)。 3、哮喘組、AG490組、地塞米松組小鼠肺泡灌洗液中細胞總數、中性粒細胞、嗜酸粒細胞和淋巴細胞計數均較正常對照組明顯增多(P0.01);地塞米松治療組與哮喘組相比,細胞總數、中性粒細胞、嗜酸粒細胞和淋巴細胞計數明顯減少(P0.01),AG490組上述指標較哮喘組也有所下降(P0.05)；地塞米松組肺泡灌洗液中細胞總數及嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數低于AG490組(P0.05)。 4、免疫組化及western blot分析顯示對照組幾乎無p-STAT3蛋白表達,哮喘組小鼠肺組織p-STAT3蛋白表達較對照組增加(P0.05),AG490組小鼠肺組織p-STAT3蛋白表達較哮喘組減弱(P0.05)；熒光定量PCR顯示哮喘組、AG490組小鼠肺組織STAT3mRNA較對照組增加(P0.05),兩組相比,無明顯差異(P0.05)。 5、地塞米松組小鼠氣道重構指標WAm/Pbm、WAt/Pbm高于對照組(P0.05),低于哮喘組(P0.05)。Western blot法檢測地塞米松組IL-21、IL-21R、 p-STAT3在肺組織中的表達較哮喘組下降(P0.05)；AG490組小鼠IL-21的表達較哮喘組下降(P0.05),與地塞米松組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05),AG490組小鼠肺組織p-STAT3的表達與地塞米松組相比,無統(tǒng)計學意義(P0.05);AG490組小鼠肺組織STAT3mRNA的含量較對照增加(P0.05),但與哮喘組小鼠相比,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 6、相關性分析結果：用western blot法測定IL-21蛋白、IL-21R蛋白、p-STAT3蛋白,結果表明上述指標與小鼠肺泡灌洗液中細胞總數、嗜酸性粒細胞計數均呈正相關(r0.5, p0.01);IL-21、IL-21R、p-STAT3的蛋白表達量與小鼠氣道重構指標WAm/Pbm、WAt/Pbm均呈正相關(r0.5,p0.01)。 研究結論 IL-21主要通過JAK-STAT途徑傳遞信號,本實驗首先用不同實驗方法觀察了IL-21及其受體在正常對照組及哮喘模型組小鼠肺組織中的表達,觀察了總STAT3及活化后的形式p-STAT3在小鼠肺組織中的表達,在建立慢性哮喘小鼠動物模型基礎上,使用JAK通路抑制劑AG490及地塞米松干預后觀察上述指標的變化。得出以下結論： 1、IL-21及其受體在小鼠肺組織中有表達,哮喘小鼠肺組織的表達較對照組增高,IL-21在哮喘發(fā)病中是重要的促炎因子,IL-21與受體結合參與慢性哮喘小鼠發(fā)病,并參與了氣道重塑過程； 2、STAT3及活化后的STAT3參與了哮喘發(fā)病,可能影響了氣道重塑： 3、哮喘模型經AG490作用后STAT3的活化程度降低,氣道炎癥及重塑程度減輕,其療效與地塞米松大致相當。 4、IL—21通過激活STAT3信號通路參與了哮喘疾病的發(fā)生,地塞米松下調了IL-21及其受體的表達,抑制了肺組織STAT3的活化,減輕了氣道炎癥和氣道重塑,IL-21/STAT3信號轉導通路可能為地塞米松治療哮喘的作用靶點之一。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 張寒冰;張道宮;解光;欒信庸;潘新良;;AG490對喉癌細胞STAT3信號傳導通路的抑制作用[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2010年12期

2 田紅;王淑娟;董亮;;吸入糖皮質激素對哮喘大鼠氣道重塑的影響[J];泰山醫(yī)學院學報;2012年08期

3 袁雙龍;蔣莉;張曉莉;李舒帆;段宏梅;王曉非;;原發(fā)性干燥綜合癥患者血清IL-21水平及其臨床意義[J];細胞與分子免疫學雜志;2007年02期

4 李開艷;熊盛道;朱晶;曹勇;熊維寧;;沙美特羅/氟替卡松對支氣管哮喘患者血清IL-21與總IgE水平的影響[J];醫(yī)藥導報;2011年08期

，

本文編號：1769093