本文選題：特發(fā)性肺纖維化 + 高遷移率族蛋白B1　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF)是一種致命性的肺病,該病病因不明,無(wú)特異的臨床表現(xiàn),早期診斷較困難,且臨床上尚缺乏有效的治療方法,導(dǎo)致其預(yù)后差、病死率高。作為一種核蛋白的高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)十分保守,有兩種釋放方式,一種主動(dòng)釋放,在炎癥因子的刺激下,由巨噬細(xì)胞、垂體細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞主動(dòng)分泌而釋放;另一種是被動(dòng)釋放,當(dāng)細(xì)胞壞死或凋亡時(shí)能夠進(jìn)行被動(dòng)釋放。HMGB1主要參與基因中DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù),還能夠?qū)е卵装Y反應(yīng)。HMGB1可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖和肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithlial to mesenchymal transition,EMT),間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型膠原(collagenⅠ)表達(dá)增加,上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)減少。近年的研究顯示:HMGB1信號(hào)的活化與肺纖維化發(fā)展密切相關(guān),而阻斷HMGB1信號(hào)可抑制其病理進(jìn)程。但是其具體作用機(jī)制不清。體內(nèi)有很多導(dǎo)致纖維化的細(xì)胞因子,其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta,TGF-β1)是非常重要的一個(gè)致纖維化的細(xì)胞因子,能夠誘導(dǎo)啟動(dòng)成纖維細(xì)胞開(kāi)始分裂增殖,并且導(dǎo)致成纖維細(xì)胞能大量合成膠原蛋白,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增多,肺間質(zhì)最終發(fā)生膠原沉積等纖維化的組織病理學(xué)改變。目前有不少研究表明在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中,TGF-β1發(fā)揮著及其關(guān)鍵的作用。最近數(shù)年發(fā)現(xiàn),核因子κB(NF-κB)作為轉(zhuǎn)錄因子家族中發(fā)現(xiàn)的新成員,是細(xì)胞內(nèi)非常重要的核轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后,細(xì)胞內(nèi)發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控時(shí),NF-κB在其中起著核心的作用,能夠參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控,標(biāo)志著細(xì)胞已被激活。HMGB1與胞膜受體結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),其中,胞膜受體主要有糖基化晚期終末產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)和 Toll 樣受體(Toll-like receptor,TLR)。HMGB1與受體結(jié)合后,均能夠活化NF-κB,NF-κB發(fā)生核內(nèi)轉(zhuǎn)移,進(jìn)一步誘導(dǎo)下游多種基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)合TGF-β1基因序列分析結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子含有一個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn),GGGACCCCCC。因此,我們有理由推論:胞外HMGB1通過(guò)與RAGE/TOLL受體結(jié)合,激活NF-κB,導(dǎo)致其細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,與TGF-β1的啟動(dòng)子結(jié)合誘導(dǎo)TGF-β1大量表達(dá),從而介導(dǎo)肺部成纖維細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,最終促進(jìn)IPF的發(fā)生發(fā)展。綜上所述,對(duì)比HMGB1與TGF-β1的作用機(jī)制,本課題提出如下的科學(xué)假說(shuō):HMGB1通過(guò)激活NF-κB,導(dǎo)致其細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)錄調(diào)控TGF-β1的表達(dá),誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而控制IPF的發(fā)展進(jìn)程。如果該推論成立,我們有望通過(guò)發(fā)現(xiàn)更多有效的分子靶點(diǎn)抑制肺泡上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化,控制IPF的發(fā)生發(fā)展。方法:①臨床收集IPF患者正常肺組織和肺纖維化肺組織的標(biāo)本,均采用HE染色,對(duì)比肺纖維化的程度;IPF患者正常肺組織和肺纖維化肺組織中HMGB1均采用免疫組化染色,對(duì)比HMGB1的表達(dá)量。②制備肺纖維化小鼠動(dòng)物模型,采用免疫組化法對(duì)IPF小鼠正常肺組織和肺纖維化肺組織中HMGB1和TGF-β1進(jìn)行染色,分別比較正常肺組織和肺纖維化肺組織中HMGB1蛋白表達(dá)量,以及TGF-β1的蛋白表達(dá)量。③HMGB1與人肺成纖維細(xì)胞株MRC-5共孵育,分別采用RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)α-SMA和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)量;采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1的蛋白表達(dá)量。④HMGB1與MRC-5共孵育過(guò)程中,加入TGF-β1中和性抗體,然后分別采用RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)α-SMA和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)量。⑤HMGB1與MRC-5共孵育,Western Blot方法檢測(cè)NF-κB的蛋白表達(dá)量。⑥HMGB1與MRC-5共孵育過(guò)程中,加入NF-κB表達(dá)的抑制劑吡咯烷銨(PDTC),Western Blot 方法檢測(cè) TGF-β1、α-SMA 和 collagen Ⅰ的蛋白表達(dá)量。⑦HMGB1與MRC-5共孵育過(guò)程中,加入TGF-β1中和性抗體,Western Blot方法檢測(cè)NF-κB的蛋白表達(dá)量。結(jié)果:①IPF患者正常肺組織和肺纖維化肺組織均采用HE染色,發(fā)現(xiàn)肺纖維化肺組織肺纖維化顯著;IPF患者正常肺組織和肺纖維化肺組織中HMGB1均采用免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)肺纖維化肺組織中HMGB1表達(dá)明顯增多。②IPF小鼠正常肺組織和肺纖維化肺組織中HMGB1和TGF-β1均采用免疫組化法染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),和正常肺組織相比,肺纖維化肺組織中HMGB1和TGF-β1表達(dá)均明顯增多。③HMGB1與MRC-5共孵育,細(xì)胞中α-SMA和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)量均增多;當(dāng) 10ug/mL HMGB1 與 MRC-5 孵育 72h,細(xì)胞中 α-SMA 和 collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)量達(dá)到高峰,且細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1的蛋白表達(dá)量達(dá)到高峰。④HMGB1與MRC-5共孵育過(guò)程中,加入TGF-β1封閉性抗體,細(xì)胞中α-SMA和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)量均減少。⑤HMGB1與MRC-5共孵育,細(xì)胞中NF-κB的蛋白表達(dá)量增多。⑥HMGB1與MRC-5共孵育過(guò)程中,加入PDTC后,細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA和collagen Ⅰ的蛋白表達(dá)量均減少。⑦HMGB1與MRC-5共孵育過(guò)程中,加入TGF-β1封閉性抗體后,細(xì)胞中NF-κB的蛋白表達(dá)量未受影響。結(jié)論:本研究結(jié)果證實(shí)HMGB1通過(guò)影響NF-κB的表達(dá),NF-κB激活后與TGF-β1的啟動(dòng)子結(jié)合,誘導(dǎo)TGF-β2的表達(dá),促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促IPF進(jìn)展。NF-κB是TGF-β1表達(dá)的上游調(diào)節(jié)基因,明確HMGB1促IPF進(jìn)展的作用機(jī)制。由此,我們闡明HMGB1/NF-κB/TGF-β1信號(hào)通路活化在IPF進(jìn)展中的作用分子機(jī)制,為尋找有效的靶點(diǎn)抑制IPF的進(jìn)展提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù),為臨床治療IPF帶來(lái)新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R563

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本文編號(hào)：1768919