本文選題：急性肺損傷　切入點(diǎn)：髓樣細(xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體-2　出處：《中南大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是多種呼吸系統(tǒng)疾病的共同通路,其發(fā)生發(fā)展過程可分為早期的急性炎性損傷、中期的肺細(xì)胞激活與成纖維細(xì)胞增殖以及后期的肺組織膠原沉積三個(gè)階段。革蘭氏陰性菌引起的感染是ALI的主要致病因素,其外膜上的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可活化多種炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等,使大量炎癥因子釋放失控并產(chǎn)生放大效應(yīng),進(jìn)而打破炎癥自限機(jī)制,產(chǎn)生自身破壞性的過度炎癥反應(yīng),使機(jī)體出現(xiàn)呼吸窘迫、非心源性肺水腫及低氧血癥等。因此,尋找在ALI早期可切斷炎癥啟動(dòng)和自動(dòng)瀑布式反應(yīng)的治療靶點(diǎn),從而促進(jìn)肺組織的損傷修復(fù),具有重要的臨床意義。 肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage, AM)是肺內(nèi)接觸抗原最早的常駐細(xì)胞,參與肺內(nèi)早期炎癥的啟動(dòng)與維持。AM作為吞噬細(xì)胞吞噬、殺死和消化微生物,是固有免疫的重要組成部分,在適應(yīng)性免疫應(yīng)答的多個(gè)階段中發(fā)揮重要作用,其功能狀態(tài)可影響ALI的發(fā)生發(fā)展。AM表面表達(dá)多種可識(shí)別病原體的受體,如Toll樣受體(toll like receptor, TLR)、趨化性細(xì)胞因子受體及清道夫受體等,這些受體激活后,可向胞內(nèi)傳遞免疫調(diào)節(jié)信號(hào),是ALI早期炎癥啟動(dòng)的主要因素之一。肺成纖維細(xì)胞的主要功能是分泌細(xì)胞外基質(zhì)的前體,維持肺組織結(jié)構(gòu)的完整性,是ALI時(shí)參與肺損傷修復(fù)的重要效應(yīng)細(xì)胞之一。 髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體(triggering receptors expressed on myeloid cells, TREMs)是一種與激活自然殺傷細(xì)胞受體同源的IgG樣受體。人類TREMs家族已確認(rèn)的成員有6個(gè),主要以膜型受體和可溶型受體兩種形式存在,膜型受體包括TREM-1、TREM-2、TREM-3、TREM樣受體-1(TREM like receptor-1,TLT-1)、TLT-2及TLT-4；而可溶型受體有sTREM-1、sTREM-2和sTLT-1。其中TREM-2是一種主動(dòng)免疫抑制性受體,可誘導(dǎo)趨化因子的表達(dá),并促使樹突狀細(xì)胞從周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移到主干淋巴結(jié),最終起到調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞功能的作用；抑制TLR配體對(duì)巨噬細(xì)胞的激活；促進(jìn)骨髓來源的巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬,提示TREM-2可潛在調(diào)控并改善嚴(yán)重膿毒血癥和慢性炎癥。 本課題觀察到TREM-2在AM和成纖維細(xì)胞表達(dá)較為豐富。因此,深入研究TREM-2對(duì)AM炎癥啟動(dòng)與放大和對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響,可明確TREM-2在ALI早期的作用及地位,有利于闡明ALI的發(fā)病機(jī)制,篩選新的治療靶點(diǎn)。 血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)是肺內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)肽之一,具有增強(qiáng)支氣管上皮細(xì)胞的趨化遷移、擴(kuò)張血管、舒張氣道平滑肌、清除氧自由基及抗細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)作用。肺內(nèi)VIP是否可通過調(diào)控TREM-2的表達(dá),使ALI時(shí)肺內(nèi)炎癥反應(yīng)和損傷修復(fù)處于對(duì)機(jī)體有利而又不會(huì)造成組織器官損傷的范圍內(nèi)值得探討。 目的：分析ALI時(shí)肺內(nèi)TREMs家族表達(dá)譜的變化,探討TREM-2在肺內(nèi)的功能以及VIP對(duì)TREM-2的表達(dá)調(diào)控。 方法：(1)腹腔注射LPS復(fù)制小鼠ALI動(dòng)物模型,采用Buxco小動(dòng)物呼吸功能檢測(cè)系統(tǒng)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)驗(yàn)證模型的建立；RT-PCR和Western Blot法檢測(cè)肺組織中TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4的表達(dá)；RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AM、成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞TREM-1、TREM-2、 TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4的表達(dá)。(2)構(gòu)建pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染AM,采用熒光顯微鏡、RT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TREM-2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和表達(dá)；RT-PCR和ELISA檢測(cè)TREM-2對(duì)LPS應(yīng)激的AM中TNF-a和IL-10表達(dá)的影響; RT-PCR檢測(cè)TREM-2對(duì)LPS應(yīng)激的AM中NF-κB mRNA表達(dá)的影響,免疫熒光檢測(cè)TREM-2對(duì)LPS應(yīng)激的AM中NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響。(3)pEGFP-N1質(zhì)粒和pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞,采用熒光顯微鏡和Real-time PCR檢測(cè)pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)和PI染色檢測(cè)TREM-2對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響；RT-PCR和凋亡蛋白活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)成纖維細(xì)胞caspase3、 caspase8及caspase9的表達(dá)和活性。(4)構(gòu)建pGC-FU-VIP重組慢病毒并感染昆明小鼠；RT-PCR和Western Blot檢測(cè)VIP對(duì)ALI小鼠肺組織中TREM-2表達(dá)的影響,并采用Real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VIP對(duì)LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-2表達(dá)的調(diào)控及其機(jī)制。 結(jié)果： 1.ALI時(shí)小鼠肺內(nèi)TREMs家族的表達(dá)譜分析 (1) Buxco小動(dòng)物肺功能檢測(cè)顯示：ALI小鼠的呼吸頻率、肺順應(yīng)性、潮氣量均低于正常小鼠；而ALI小鼠氣道阻力明顯大于正常小鼠的氣道阻力(P0.05)。進(jìn)一步采用HE染色觀察到ALI小鼠的肺泡隔增厚,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),滲出明顯增加。 (2) TREMs家族的主要成員TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4在正常小鼠肺組織中均有表達(dá),其中以TREM-1的表達(dá)最少,TREM-2的表達(dá)最多。與正常組相比,ALI組小鼠肺組織中TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2和TLT-4mRNA的表達(dá)均明顯升高,而TREM-2mRNA的表達(dá)降低(P0.05)。Western Blot檢測(cè)TREM-1和TREM-2表達(dá)的結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。 (3) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：靜息狀態(tài)的成纖維細(xì)胞、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞均表達(dá)TREM-2mRNA,但未見明顯的TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4mRNA的表達(dá)；靜息狀態(tài)的AM表達(dá)TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4mRNA,而LPS應(yīng)激的AM中TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4mRNA表達(dá)均升高,但TREM-2mRNA表達(dá)降低(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果與上述RT-PCR結(jié)果一致。 2. pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及TREM-2對(duì)AM炎癥啟動(dòng)和放大效應(yīng)的影響 (1)成功構(gòu)建pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染至AM。熒光顯微鏡檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染效率約為40%。RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檢測(cè)顯示pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM中TREM-2表達(dá)明顯高于pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P0.01)。 (2) RT-PCR檢測(cè)顯示LPS應(yīng)激的AM中TNF-a mRNA表達(dá)明顯增加。與LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒組相比,LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的AM中TNF-a mRNA表達(dá)明顯降低。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM的上清液中TNF-a蛋白含量(260.64±47.58) pg/mL明顯低于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(352.16±43.82) pg/mL(P0.05)。 (3) RT-PCR檢測(cè)表明：與LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM中IL-10mRNA表達(dá)明顯升高。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM的上清液中IL-10蛋白含量(242.96±63.23) pg/mL明顯高于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(184.38±34.33) pg/mL (P0.05)。 (4)LPS組的AM中NF-κB mRNA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組；LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的AM中NF-κB mRNA的表達(dá)明顯高于pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM中NF-κB mRNA的表達(dá)明顯低于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P0.05)。與正常對(duì)照組相比,LPS應(yīng)激的AM中NF-κB的核轉(zhuǎn)位明顯增多；LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM中NF-κB核轉(zhuǎn)位明顯少于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。 3. TREM-2對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞凋亡的影響 (1)pEGFP-N1和pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠成纖維細(xì)胞后,Real-time PCR檢測(cè)顯示pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的小鼠成纖維細(xì)胞TREM-2mRNA表達(dá)明顯高于pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P0.01)。 (2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠成纖維細(xì)胞G1期百分比(70.88%±1.17%)高于pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(67.13%±1.35%),且pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠成纖維細(xì)胞的凋亡率(0.96%±0.16%)大于pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(0.66%±0.05%)。PI染色結(jié)果表明：LPS處理可顯著增加成纖維細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比,而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(23.67%±8.08%)中凋亡細(xì)胞的百分比明顯低于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(59.33%±17.34%)(P0.01)。 (3)與正常對(duì)照組相比,LPS應(yīng)激的小鼠成纖維細(xì)胞caspase3、 caspase8和caspase9mRNA表達(dá)升高,而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠成纖維細(xì)胞caspase3、caspase8和caspase9mRNA表達(dá)明顯低于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P0.05)。LPS應(yīng)激的小鼠成纖維細(xì)胞caspase3、caspase8及caspase9活性均顯著強(qiáng)于正常對(duì)照組,而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的小鼠成纖維細(xì)胞caspase3、caspase8及caspase9活性均弱于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P0.05)。 4.VIP對(duì)ALI時(shí)TREM-2的表達(dá)調(diào)控 (1) pGC-FU-VIP重組慢病毒構(gòu)建成功后,熒光顯微鏡觀察到肺內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度與pGC-FU-VIP重組慢病毒滴度呈正相關(guān)。RT-PCR檢測(cè)顯示ALI小鼠肺組織VIP mRNA表達(dá)升高,而感染pGC-FU-VIP重組慢病毒的ALI小鼠肺組織中VIP mRNA表達(dá)明顯高于ALI組及感染pGC-FU慢病毒的ALI小鼠(P0.01)。 (2)與正常對(duì)照組相比,ALI組小鼠肺組織TREM-2mRNA表達(dá)降低,而VIP可增加ALI組小鼠肺組織TREM-2mRNA表達(dá)(P0.01)。不同濃度(10-10、10-9、10-8、10-7和10-6mol/L)的VIP對(duì)靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞TREM-2表達(dá)無明顯影響(P0.05)；VIP(10-8mol/L)處理后不同時(shí)間點(diǎn)(0、2、4、6、12和24h)巨噬細(xì)胞TREM-2mRNA表達(dá)無明顯變化(P0.05)；VIP可呈劑量和時(shí)間依賴性上調(diào)LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-2mRNA的表達(dá)(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示VIP對(duì)靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞TREM-2表達(dá)無明顯影響,但可增加LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-2的表達(dá)(P0.01)。 (3)RT-PCR檢測(cè)表明VIP受體拮抗劑可減少VIP對(duì)LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-2mRNA的表達(dá)(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示：與LPS+VIP組相比,LPS+VIP+VIP受體拮抗劑組巨噬細(xì)胞TREM-2蛋白表達(dá)降低(P0.05)；與LPS+VIP組相比,信號(hào)通路阻斷劑H-89和PD98059可降低巨噬細(xì)胞TREM-2的表達(dá)(P0.01)。 (4)通過JASPAR和IFTI數(shù)據(jù)庫對(duì)調(diào)控小鼠肺內(nèi)TREM-2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示AP1和NF-κB可能是調(diào)控TREM-2表達(dá)的核心轉(zhuǎn)錄因子；Real-time PCR檢測(cè)表明VIP可增加LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞AP1mRNA的表達(dá)(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：采用NF-κB抑制劑可增加LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-2的平均熒光強(qiáng)度(P0.05)。 結(jié)論： 1.AM表達(dá)TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4,在ALI時(shí)表達(dá)均增加；而TREM-2廣泛表達(dá)于AM、成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞等多種肺系細(xì)胞,在ALI時(shí)表達(dá)降低。 2. TREM-2可抑制LPS應(yīng)激的AM中NF-κB的活化,影響AM的激活,進(jìn)而切斷早期炎癥的啟動(dòng)和放大。 3. TREM-2可抑制死亡受體和線粒體介導(dǎo)的凋亡通路,減少LPS應(yīng)激的成纖維細(xì)胞的凋亡,維持成纖維細(xì)胞數(shù)量和功能的動(dòng)態(tài)平衡,有利于受損肺組織的及時(shí)修復(fù)。 4.VIP可通過PKA和ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路上調(diào)核心轉(zhuǎn)錄因子AP1的表達(dá),抑制NF-κB的活化,從而增加TREM-2的生成,參與肺組織的損傷修復(fù)。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1707619