本文選題：間充質干細胞　切入點：樹突狀細胞　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：實驗目的:研究BMSCs減輕急性哮喘模型小鼠炎癥反應的機制,進一步探討B(tài)MSCs與DCs自噬以及哮喘之間的關系。實驗方法:1.BMSCs通過抑制肺內樹突狀細胞自噬緩解哮喘模型小鼠病情將BABL/B小鼠分為對照組,哮喘組,BMSCs治療組,分別造模后,通過流式細胞術檢測小鼠肺內和縱隔淋巴結內樹突狀細胞及其表面共刺激分子表達比例;通過ELISA檢測小鼠血清中的Ig E水平以及BALF液中的Th2型細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13和IL-10)水平;通過肺組織HE以及PAS染色觀察肺內炎癥細胞浸潤以及粘液分泌情況。通過western blot檢測肺內樹突狀細胞自噬蛋白表達情況。2.體外實驗觀察BMSCs是否通過抑制自噬調節(jié)樹突狀細胞功能分別收集體外培養(yǎng)的BMSCs與未成熟DCs(imature dendritic cells,im DCs),將BMSCs與im DCs預處理后,用LPS分別刺激對照組DCs(control bone marrow derived dendritic cells,Ctr-BMDCs)和BMSCs conditioned BMDCs,分別使用ELISA檢測細胞因子(IL-6,TNF-α)的水平,FACS檢測BMDCs表面共刺激分子的表達情況,刺激OTⅡT細胞增殖能力以及吞噬OVA抗原的能力,并通過加入自噬刺激劑進一步觀察DCs這些功能的變化。3.體外實驗觀察IL-10對BMDCs自噬以及功能的影響。(1)在體外將BMDCs分為BMDCs組、LPS刺激組、IL-10-treated-BMDCs+LPS組。通過流式細胞分析檢測BMDCs表面共刺激分子的表達情況以及刺激T細胞增殖情況,ELISA檢測各組BMDCs分泌細胞因子的情況。(2)用IL-10預處理體外培養(yǎng)的im DCs后,將BMDCs分為ctr-BMDCs組,LPS刺激組,LPS刺激IL-10-conditioned BMDCs組,以及雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)+LPS處理IL-10-conditioned BMDCs組,通過流式細胞分析術檢測BMDCs活化情況和刺激T細胞增殖情況,酶聯(lián)免疫實驗觀察BMDCs產生細胞因子的能力,以及流式細胞術檢測BMDCs攝取OVA抗原的能力。(3)用LPS刺激體外培養(yǎng)的im DCs,收集不同時間點的BMDCs,進行western blot檢測自噬相關蛋白的表達情況,找到檢測最佳時間點,并在這個時間點觀察IL-10對LPS誘導BMDCs自噬的影響。4.實驗數(shù)據(jù)處理以及統(tǒng)計學分析本實驗過程涉及的所有實驗數(shù)據(jù)采用Prism Graph Pad 6軟件進行統(tǒng)計學分析,所有計量數(shù)據(jù)均以x±s表示。統(tǒng)計分析前先對各組數(shù)據(jù)先進行正態(tài)檢驗和方差分析,符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,不符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)則采用Kruskal-Wallis檢驗。結果以P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。實驗結果:1.BMSCs能通過抑制肺BMDCs自噬和功能緩解哮喘模型小鼠病情(1)BMSCs處理組小鼠肺組織切片炎癥細胞數(shù)和粘液分泌水平、肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)、肺泡灌洗中的Th2型細胞因子(IL-4,IL-5)以及血清中Ig E水平均明顯低于哮喘模型組。而BMSCs處理組小鼠的肺泡灌洗液中的IL-10水平卻明顯高于哮喘模型組。(2)BMSCs處理組小鼠肺及縱隔淋巴結中的DCs比例以及表面共刺激分子表達情況均明顯低于哮喘小鼠組,并且具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)哮喘組小鼠肺DCs自噬水平明顯高于對照組(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯增加),BMSCs處理后,肺內DCs自噬水平明顯降低,并且具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.BMSCs可能通過抑制自噬調節(jié)樹突狀細胞功能(1)相比于ctr-DCs,LPS刺激后,BMSCs treated-DCs表面共刺激分子(MHCⅡ,CD86)表達明顯降低,分泌IL-6和TNF-α的能力明顯減弱,刺激T細胞增殖明顯降低。差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)進一步通過加入自噬刺激劑雷帕霉素進行拯救實驗發(fā)現(xiàn),BMSCs對DCs的抑制作用,在加入雷帕霉素后得到完全或者部分恢復:加入雷帕霉素組,BMDCs表面共刺激分子CD86,MHCⅡ,CD40,CD80表達較單純BMSCs處理組明顯增加,分泌細胞因子(IL-6)水平也明顯增加,并且均具有統(tǒng)計學意義。3.IL-10通過抑制自噬調節(jié)樹突狀細胞功能(1)在LPS刺激后,IL-10 treated-BMDC表面共刺激分子表達水平,刺激T細胞增殖能力以及分泌細胞因子(IL-6,TNF-α)的水平較ctr-BMDCs均明顯降低,并且具有統(tǒng)計學意義。而這種抑制作用,在加入自噬刺激劑雷帕霉素后出現(xiàn)了逆轉。并且具有統(tǒng)計學意義。(2)LPS能夠刺激BMDCs發(fā)生自噬,并且在12小時時間點,可以觀察到明顯的自噬現(xiàn)象,并且IL-10處理后的BMDCs自噬水平較ctr-DCs明顯降低(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯降低)。實驗結論:BMSCs可以減輕急性哮喘模型小鼠的炎癥反應,并且可能通過分泌IL-10抑制肺DCs自噬水平并負向調節(jié)其功能從而改善哮喘。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

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本文編號：1632756