本文選題：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2　切入點(diǎn)：周期蛋白E1　出處：《華中科技大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和周期蛋白E1在香煙煙霧暴露致大鼠肺血管重塑中的表達(dá)變化 目的：探討香煙煙霧暴露大鼠肺血管中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)和周期蛋白E1(cyclinE1)的表達(dá)變化以及它們與香煙煙霧暴露致大鼠肺血管重塑程度的關(guān)系。 方法：24只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為四組：C組(對照組),S-1M(煙霧暴露1月組),S-3M(煙霧暴露3月組)和S-6M(煙霧暴露6月組)。HE染色觀察肺血管壁增厚情況,平滑肌細(xì)胞α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)染色觀察肺小血管肌化程度。免疫組織化學(xué)染色觀察ERK1/2和cyclinE1在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌中的定位表達(dá),Western blotting法檢測大鼠肺動(dòng)脈平滑肌中ERK1/2和cyclinE1的蛋白表達(dá)量。 結(jié)果：隨煙霧暴露時(shí)間的延長,完全肌化血管比例、肺血管壁厚度與血管直徑的比值(WT)、ERK1/2和cyclinE1的蛋白表達(dá)隨煙霧暴露時(shí)間延長而顯著增加。ERK1/2與cyclinE1表達(dá)與大鼠肺WT值以及完全肌化血管比例成顯著正相關(guān),ERK1/2與cyclinE1的表達(dá)量之間也成顯著正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論：香煙煙霧暴露可以導(dǎo)致大鼠肺血管重塑。同時(shí),活化的ERK1/2和cyclinE1在香煙煙霧暴露大鼠肺血管中的表達(dá)顯著增加且與煙霧暴露時(shí)間成正相關(guān),提示提示活化的ERK1/2和cyclinE1可能與香煙煙霧暴露所致的大鼠肺血管重塑有關(guān)。 第二部分細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和周期蛋白E1在香煙煙霧提取物致大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用以及二者的關(guān)系 目的：探討細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)是否通過上調(diào)周期蛋白E1(cyclinE1)的表達(dá)進(jìn)而參與調(diào)節(jié)香煙煙霧提取物(CSE)刺激培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(rPASMCs)的異常增殖。 方法：進(jìn)行大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng),根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以往研究結(jié)果,選擇對細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用最強(qiáng)的2%CSE進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為驗(yàn)證cyclinE1在CSE導(dǎo)致的rPASMCs增殖中的作用,將細(xì)胞分為4組：control組,2%CSE組,NCsiRNA組,CE1siRNA組。為探索ERK1/2在CSE導(dǎo)致的rPASMCs增殖中的作用及其對cyclinE1的調(diào)控作用,再將細(xì)胞分為另外4組：control組,2%CSE組,PD98059組,2%CSE+PD98059組。各組細(xì)胞同步化后給予2%CSE和干預(yù)藥物進(jìn)行共培養(yǎng)。使用臺(tái)盼藍(lán)染色直接細(xì)胞計(jì)數(shù)法和BrdU摻入法檢測細(xì)胞增殖情況。Western blotting和免疫熒光染色檢測ERK1/2和cyclinE1的蛋白表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布。 結(jié)果：2%CSE能上調(diào)cyclinEl和磷酸化ERK1/2的表達(dá),并進(jìn)而引起rPASMCs異常增殖。cyclinE1siRNA可以抑制2%CSE對cyclinEl的上調(diào)作用,從而抑制rPASMCs的異常增殖。PD98059可以抑制2%CSE對ERK1/2的磷酸化作用和對cyclinE1的上調(diào)作用,并可以導(dǎo)致細(xì)胞G1期停滯和部分抑制rPASMCs的異常增殖。 結(jié)論：活化的ERK1/2在CSE誘導(dǎo)的rPASMCs異常增殖中發(fā)揮重要作用,其部分原因可能是通過上調(diào)cyclinE1的表達(dá)。 第三部分細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2的小干擾RNA能夠通過下調(diào)cyclinE1的表達(dá)而減輕香煙煙霧暴露大鼠肺血管重塑的程度 目的：探討ERK1/2-cyclinE1信號(hào)通路在香煙煙霧暴露大鼠肺血管重塑中的作用。 方法：構(gòu)建ERK1和ERK2的siRNA,分別轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的rPASMCs內(nèi)和氣管注射入大鼠肺血管內(nèi),以降低rPASMCs和大鼠肺血管中的ERKl/2的表達(dá)。rPASMCs以CSE刺激培養(yǎng),大鼠則暴露于香煙煙霧或者空氣中12周。使用臺(tái)盼藍(lán)染色直接細(xì)胞計(jì)數(shù)法和BrdU摻入法檢測細(xì)胞增殖情況。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測ERK1/2和cyclinE1的mRNA表達(dá)水平。Western blotting和免疫組織化學(xué)染色檢測ERK1/2和cyclinEl的蛋白表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的分布。HE染色和平滑肌細(xì)胞a-SMA染色觀察肺血管重塑情況。 結(jié)果:ERKl/2siRNA有效抑制了CSE刺激培養(yǎng)的rPASMCs中ERK1/2和cyclinE1的mRNA和蛋白表達(dá),造成細(xì)胞G1期停滯,部分抑制細(xì)胞增殖。而在大鼠體內(nèi),ERK1/2siRNA降低了香煙煙霧暴露大鼠肺血管中ERK1/2和cyclinE1的mRNA和蛋白表達(dá),減輕了大鼠肺血管重塑程度。 結(jié)論：ERK1/2-cyclinEl信號(hào)通路在香煙煙霧暴露大鼠肺血管重塑中具有重要作用,ERK1/2siRNA可以通過下調(diào)cyclinE1表達(dá)而改善大鼠肺血管重塑程度。
[Abstract]:Part 1 expression of extracellular signal regulated kinase 1/2 and cyclin E1 in pulmonary vascular remodeling in rats exposed to cigarette smoke
Objective: To investigate the expression changes of extracellular signal regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and cyclin E1 (cyclinE1) in pulmonary vessels of cigarette smoke exposed rats and their relationship with the degree of pulmonary vascular remodeling in rats exposed to cigarette smoke.
Methods: 24 adult male Wistar rats were randomly divided into four groups: group C (control group), S-1M (January, S-3M smoke exposure group (March) smoke exposure group) and S-6M (June, smoke exposure group) to observe the pulmonary vascular wall thickening,.HE staining, smooth muscle actin (alpha -SMA) staining. Muscularization degree. To observe the localization of ERK1/2 and cyclinE1 in pulmonary arterial smooth muscle of rats the expression of immunohistochemical staining, the expression of ERK1/2 and cyclinE1 detection of rat pulmonary artery smooth muscle Western blotting in protein level.
Results: with exposure time prolonging, fully vascularized muscle ratio, the ratio of pulmonary vascular wall thickness and vessel diameter (WT), the expression of ERK1/2 and cyclinE1 protein with smoke exposure time increased.ERK1/2 and cyclinE1 expression in WT rats with pulmonary vascular muscle ratio value and completely positively related to it was a significant positive correlation between the expression of ERK1/2 and cyclinE1.
Conclusion: cigarette smoke exposure can lead to pulmonary vascular remodeling in rats. At the same time, the activation of ERK1/2 and cyclinE1 expression in pulmonary vessels exposed to cigarette smoke in rats increased significantly and the smoke exposure time is positively related, suggesting that pulmonary vascular remodeling in rats suggests that ERK1/2 and cyclinE1 may be activated and induced by cigarette smoke exposure.
The second part is the role of extracellular signal regulated kinase 1/2 and cyclin E1 in the proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells induced by cigarette smoke extract and the relationship between the two.
Objective: To investigate whether extracellular signal regulated kinase 1/2 (ERK1/2) can regulate the abnormal proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells (rPASMCs) stimulated by cigarette smoke extract (CSE) by up regulating the expression of cyclin E1 (cyclinE1).
Methods: primary cultured rat pulmonary artery smooth muscle cells, according to the previous research results, selection of cell proliferation promoting effect of the strongest 2%CSE experiment. In order to verify cyclinE1 in CSE induced rPASMCs proliferation, cells were divided into 4 groups: control group, 2%CSE group, NCsiRNA group, CE1siRNA ERK1/2 in CSE group. In order to explore the cause of rPASMCs proliferation and the regulation effect on cyclinE1, and then the cells were divided into 4 groups: control group, 2%CSE group, PD98059 group, 2%CSE+PD98059 group. The cells were synchronized after treated with 2%CSE and drug intervention were co cultured. Trypan blue to direct cell counting method and BrdU incorporation method of cell proliferation was detected by.Western blotting and immunofluorescence staining of ERK1/2 and cyclinE1 protein expression levels. To detect the distribution of cell cycle by flow cytometry.
Results: 2%CSE could up regulate the expression of cyclinEl and phosphorylation of ERK1/2 and rPASMCs, and cause abnormal proliferation of.CyclinE1siRNA can inhibit the up regulation of 2%CSE on cyclinEl, thereby inhibiting abnormal proliferation of.PD98059 rPASMCs can inhibit 2%CSE phosphorylation of ERK1/2 and up regulation of cyclinE1, and can lead to cell G1 arrest and inhibition of rPASMCs abnormal proliferation.
Conclusion: activated ERK1/2 plays an important role in the abnormal proliferation of rPASMCs induced by CSE, partly due to the up-regulation of cyclinE1 expression.
The third part of the small interference RNA of extracellular signal regulated kinase 1/2 can reduce the degree of pulmonary vascular remodeling in cigarette smoke exposed rats by downregulating the expression of cyclinE1
Objective: To investigate the role of ERK1/2-cyclinE1 signaling pathway in pulmonary vascular remodeling in rats exposed to cigarette smoke.
Methods: siRNA construction of ERK1 and ERK2, were transfected into rPASMCs in vitro and tracheal injection into the pulmonary arteries in rats, in order to reduce the expression of.RPASMCs in pulmonary vascular rPASMCs and ERKl/2 in the rat with CSE stimulated rats were exposed to cigarette smoke or air for 12 weeks. Using trypan directly cell counting and BrdU incorporation assay was used to detect proliferation of blue staining. The expression level of.Western blotting and immunohistochemistry were used to detect ERK1/2 and cyclinEl protein quantitative real-time RT-PCR detection of ERK1/2 and cyclinE1. The expression level of mRNA staining was used to observe the distribution of pulmonary vascular remodeling in.HE cell cycle was measured by flow cytometry staining of smooth muscle cells a-SMA.
Results: the expression of mRNA and ERK1/2 protein and cyclinE1 ERKl/2siRNA inhibited CSE stimulated rPASMCs, caused G1 cell cycle arrest, partial inhibition of cell proliferation. In rats, ERK1/2siRNA reduced cigarette smoke exposure mRNA and protein expression of ERK1/2 and cyclinE1 of pulmonary vessels in rats, reduce the pulmonary vessels of rats the degree of remodeling.
Conclusion: ERK1/2-cyclinEl signaling pathway plays an important role in pulmonary vascular remodeling in cigarette smoke exposed rats. ERK1/2siRNA can improve pulmonary vascular remodeling by downregulating cyclinE1 expression.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R563

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本文編號(hào)：1584508