本文關(guān)鍵詞： p38絲裂原活化蛋白激酶 c-Jun氨基端激酶 肺泡上皮細(xì)胞 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化 轉(zhuǎn)分化生長因子-β1 沙利度胺　出處：《武漢大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：探討MAPK家族P38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-Jun氨基端激酶(JNK)信號(hào)通道在TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)中的意義,以及沙利度胺對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的EMT的作用以及對(duì)MAPK家族成員JNK、P38MAPK的影響,從而進(jìn)一步揭示肺纖維化的發(fā)病機(jī)制,闡明沙利度胺抗肺纖維化的機(jī)理,為肺纖維化的治療尋找新的切入點(diǎn)。 方法： 第一部分A549細(xì)胞在含TGF-β1(3ng/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí),從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT); JNK特異抑制物(SP-600125)預(yù)處理1小時(shí),P38MAPK特異抑制物(SB-203580)預(yù)處理1小時(shí),然后在含3ng/ml TGF-β1培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)；基因沉默組在shRNA轉(zhuǎn)染成功后在含3ng/ml TGF-β1培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)。磷酸化的p38MAPK、JNK蛋白和mRNA檢測在TGF-β1處理30min后進(jìn)行,細(xì)胞形態(tài)評(píng)估、細(xì)胞標(biāo)志蛋白以及mRNA的檢測在TGF-β1培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行。所有組做A549細(xì)胞形態(tài)評(píng)估,并通過免疫印跡法(western blotting)檢測A549細(xì)胞磷酸化p38MAPK和JNK的蛋白,以及間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白包括結(jié)蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)、α-肌動(dòng)蛋白(a-SMA)和上皮細(xì)胞表型蛋白包括E-鈣粘素(E-cadherin)、緊密連接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)、水通道蛋白-5(aquaporin-5,AQP-5)的表達(dá)�；虺聊M還需通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測A549細(xì)胞的P38MAPK和JNK的mRNA.第二部分沙利度胺溶解于二甲基亞砜(DMSO),A549細(xì)胞分為3組：A：對(duì)照組；B:TGF-pl+DMSO組(DMSO提前預(yù)處理24小時(shí),然后給予TGF-β1); C: TGF-β1+沙利度胺組(沙利度胺含量為10μg/ml,提前預(yù)處理24小時(shí),然后給予TGF-β1)；TGF-β1含量為3ng/ml,孵育48h,磷酸化的p38MAPK、JNK蛋白和mRNA檢測在TGF-β1處理30min后進(jìn)行,細(xì)胞形態(tài)評(píng)估和細(xì)胞標(biāo)志蛋白的檢測在含TGF-β1培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行。所有組行A549細(xì)胞形態(tài)評(píng)估,并通過免疫印跡法(western blotting)檢測A549細(xì)胞磷酸化p38MAPK和JNK的蛋白,以及間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白包括desmin、vimentin、α-SMA和上皮細(xì)胞表型蛋白包括E-cadherin、ZO-1、AQP-5的表達(dá)。 結(jié)果： 第一部分A549細(xì)胞在TGF-β1誘導(dǎo)48小時(shí)后表現(xiàn)出類成纖維細(xì)胞表型,細(xì)胞間連接減少。TGF-β1顯著減少肺泡上皮細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E-鈣粘素、ZO-1和AQP-5的表達(dá)(p0.05),與此對(duì)應(yīng)的是增加成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、desmin和vimentin的表達(dá)(p0.05)。TGF-β1顯著增加A549細(xì)胞磷酸化的p38MAPK和磷酸化的JNK蛋白的表達(dá)(p0.05);JNK的特異抑制劑SP-600125和p38MAPK特異抑制劑SB-203580,均可以抑制A549細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,顯著抑制(p0.05)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞α-SMA、結(jié)蛋白和波形蛋白表達(dá),與此對(duì)應(yīng)的是可阻止(p0.05) TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞E-鈣粘素、ZO-1和AQP-5減少,顯著減少活性MAPK蛋白(磷酸化的JNK和磷酸化的p38MAPK)的表達(dá)(p0.05);p38MAPK和JNK基因沉默均可以抑制A549細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,可以顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞α-SMA、結(jié)蛋白和波形蛋白表達(dá)(p0.05),與此對(duì)應(yīng)的是可阻止TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞E-鈣粘素、ZO-1和AQP-5減少(p0.05),可以顯著減少p38MAPK和JNK mRNA和蛋白表達(dá)(p0.05) 第二部分沙利度胺可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,顯著抑制(p0.05) TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞α-SMA、結(jié)蛋白和波形蛋白表達(dá),與此對(duì)應(yīng)的是可阻止(p0.05)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞E-鈣粘素、ZO-1和AQP-5減少,顯著減少活性MAPK蛋白(磷酸化的JNK和磷酸化的p38MAPK)的表達(dá)(p0.05)。 結(jié)論： 1.TGF-β1可誘導(dǎo)A549細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化； 2. p38MAPK和JNK信號(hào)通道在TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程起重要作用； 3.沙利度胺可能通過抑制p38MAPK和JNK信號(hào)通道,從而抑制肺泡上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程而發(fā)揮抗纖維化作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R563.9

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本文編號(hào)：1508126