本文關鍵詞： p38絲裂原活化蛋白激酶 c-Jun氨基端激酶 肺泡上皮細胞 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化 轉(zhuǎn)分化生長因子-β1 沙利度胺　出處：《武漢大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：探討MAPK家族P38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-Jun氨基端激酶(JNK)信號通道在TGF-β1誘導的人肺泡上皮細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)中的意義,以及沙利度胺對肺泡Ⅱ型上皮細胞的EMT的作用以及對MAPK家族成員JNK、P38MAPK的影響,從而進一步揭示肺纖維化的發(fā)病機制,闡明沙利度胺抗肺纖維化的機理,為肺纖維化的治療尋找新的切入點。 方法： 第一部分A549細胞在含TGF-β1(3ng/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時,從而誘導A549細胞上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(EMT); JNK特異抑制物(SP-600125)預處理1小時,P38MAPK特異抑制物(SB-203580)預處理1小時,然后在含3ng/ml TGF-β1培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時；基因沉默組在shRNA轉(zhuǎn)染成功后在含3ng/ml TGF-β1培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。磷酸化的p38MAPK、JNK蛋白和mRNA檢測在TGF-β1處理30min后進行,細胞形態(tài)評估、細胞標志蛋白以及mRNA的檢測在TGF-β1培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后進行。所有組做A549細胞形態(tài)評估,并通過免疫印跡法(western blotting)檢測A549細胞磷酸化p38MAPK和JNK的蛋白,以及間質(zhì)細胞表型蛋白包括結(jié)蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)、α-肌動蛋白(a-SMA)和上皮細胞表型蛋白包括E-鈣粘素(E-cadherin)、緊密連接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)、水通道蛋白-5(aquaporin-5,AQP-5)的表達�；虺聊M還需通過實時熒光定量PCR方法檢測A549細胞的P38MAPK和JNK的mRNA.第二部分沙利度胺溶解于二甲基亞砜(DMSO),A549細胞分為3組：A：對照組；B:TGF-pl+DMSO組(DMSO提前預處理24小時,然后給予TGF-β1); C: TGF-β1+沙利度胺組(沙利度胺含量為10μg/ml,提前預處理24小時,然后給予TGF-β1)；TGF-β1含量為3ng/ml,孵育48h,磷酸化的p38MAPK、JNK蛋白和mRNA檢測在TGF-β1處理30min后進行,細胞形態(tài)評估和細胞標志蛋白的檢測在含TGF-β1培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后進行。所有組行A549細胞形態(tài)評估,并通過免疫印跡法(western blotting)檢測A549細胞磷酸化p38MAPK和JNK的蛋白,以及間質(zhì)細胞表型蛋白包括desmin、vimentin、α-SMA和上皮細胞表型蛋白包括E-cadherin、ZO-1、AQP-5的表達。 結(jié)果： 第一部分A549細胞在TGF-β1誘導48小時后表現(xiàn)出類成纖維細胞表型,細胞間連接減少。TGF-β1顯著減少肺泡上皮細胞的上皮標志物E-鈣粘素、ZO-1和AQP-5的表達(p0.05),與此對應的是增加成纖維細胞標志物α-SMA、desmin和vimentin的表達(p0.05)。TGF-β1顯著增加A549細胞磷酸化的p38MAPK和磷酸化的JNK蛋白的表達(p0.05);JNK的特異抑制劑SP-600125和p38MAPK特異抑制劑SB-203580,均可以抑制A549細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化,顯著抑制(p0.05)TGF-β1誘導的A549細胞α-SMA、結(jié)蛋白和波形蛋白表達,與此對應的是可阻止(p0.05) TGF-β1誘導的A549細胞E-鈣粘素、ZO-1和AQP-5減少,顯著減少活性MAPK蛋白(磷酸化的JNK和磷酸化的p38MAPK)的表達(p0.05);p38MAPK和JNK基因沉默均可以抑制A549細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化,可以顯著抑制TGF-β1誘導的A549細胞α-SMA、結(jié)蛋白和波形蛋白表達(p0.05),與此對應的是可阻止TGF-β1誘導的A549細胞E-鈣粘素、ZO-1和AQP-5減少(p0.05),可以顯著減少p38MAPK和JNK mRNA和蛋白表達(p0.05) 第二部分沙利度胺可以抑制TGF-β1誘導A549細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化,顯著抑制(p0.05) TGF-β1誘導的A549細胞α-SMA、結(jié)蛋白和波形蛋白表達,與此對應的是可阻止(p0.05)TGF-β1誘導的A549細胞E-鈣粘素、ZO-1和AQP-5減少,顯著減少活性MAPK蛋白(磷酸化的JNK和磷酸化的p38MAPK)的表達(p0.05)。 結(jié)論： 1.TGF-β1可誘導A549細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化； 2. p38MAPK和JNK信號通道在TGF-β1誘導的A549細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程起重要作用； 3.沙利度胺可能通過抑制p38MAPK和JNK信號通道,從而抑制肺泡上皮細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程而發(fā)揮抗纖維化作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R563.9

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本文編號：1508126