本文關(guān)鍵詞： 蟑螂 Blag7 T細胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白4 樹突狀細胞 Th2向極化 蟑螂 Blag7 Toll樣受體4 樹突狀細胞 絲裂原活化蛋白激酶　出處：《南京醫(yī)科大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：基于哮喘病人和哮喘動物模型的研究已經(jīng)廣泛證明Th2細胞產(chǎn)生的細胞因子，譬如IL-4，IL-5和IL-13等，它們最終促進了包括氣道炎癥，粘液分泌過多，氣道高反應性等在內(nèi)的哮喘發(fā)生。然而，由過敏原誘導的促使初始T細胞分化為Th2類細胞的機制目前仍不明確。 樹突狀細胞在受到外來抗原刺激成熟后，能夠促使初始T細胞分化為Th1或者Th2類細胞。目前如何使得抗原特異性Th2類細胞極化，以及在過敏情況下保持Th2類細胞穩(wěn)態(tài)依然未知。最新的研究表明樹突狀細胞能夠表達T細胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白4,它能夠與其配體T細胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白1相結(jié)合從而促進Th2細胞分化。這一研究為研究過敏性疾病的機制提供了一些幫助。 T細胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin mucindomain,TIM4)是一種表達與細胞表面的蛋白，它能夠調(diào)節(jié)T細胞的效應。越來越多的數(shù)據(jù)證實多種T細胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白分子在Th1和Th2型免疫反應中起了重要的作用。其中，樹突狀細胞分泌的T細胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白4已經(jīng)被證實能夠促進CD4+T細胞分化為Th2細胞，而且在外源性抗原刺激后T細胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白的表達能夠顯著性升高，但是它在過敏性疾病中的角色作用目前仍不清楚。 多種炎癥細胞及免疫細胞參與的氣道炎癥是過敏性氣道疾病的本質(zhì)。廣泛存在于免疫細胞表面的Toll樣受體，無疑可以作為危險因素與機體反應間的重要媒介。Toll樣受體是一種保守的模式識別受體家族中的一種，它能夠識別特異性的微生物和允許宿主細胞區(qū)分自我和非自身分子。樹突狀細胞能夠表達多種Toll樣受體，譬如TLR2，TLR3等。細菌等外源性刺激能夠激活TLR從而初始免疫反應，促進抗原適應免疫以應對外源性病原體。研究發(fā)現(xiàn)，TLRs廣泛分布在參與哮喘發(fā)病的免疫細胞上，以來胚系基因編碼的保守序列參與宿主防御、調(diào)節(jié)免疫和誘導耐受，與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 蟑螂在世界各地已經(jīng)被證實可以促發(fā)過敏及其特異性哮喘。在我們?nèi)粘Ｉ钪凶畛Ｒ姷捏敕N類則是德國小蠊和美洲大蠊。在過去的數(shù)十年了，多種德國小蠊過敏原（Bla g1, Bla g2, Bla g4, Bla g5, Bla g6, Bla g7and Bla g8)均已經(jīng)被克隆表達。它們其中，Bla g7是一種肌球蛋白，是一種泛過敏原且能與血清IgE結(jié)合。Bla g7與另一種美洲大蠊的肌球蛋白Per a7有著非常相似的蛋白結(jié)構(gòu)，而Per a7已經(jīng)被報道能夠促進肥大細胞系P815釋放Th2類細胞因子IL-4與IL-13，因此我們預測Bla g7可能同樣通過與TLR接觸并發(fā)揮生物學效應，具有促進Th2類細胞因子釋放的效應。樹突狀細胞是最強的抗原遞呈細胞，它能夠促進Th2類極化導致過敏的初始，在本次試驗中我們主要研究Bla g7刺激樹突狀細胞以及它背后的機制。本次試驗的目的主要是想證明Bla g7能夠通過促進樹突狀細胞表達TIM4，繼而促進CD4+T細胞分化為Th2細胞，以及Bla g7發(fā)揮免疫性效應是通過TLR方式。 第一部分重組德國小蠊過敏原Bla g7通過促進樹突狀細胞表達TIM4蛋白誘導CD4+T細胞Th2向分化 背景：蟑螂過敏原作為一個主要的戶內(nèi)過敏原，它能夠促使過敏性鼻炎和哮喘發(fā)生，但是這背后的機制目前仍不明確。 方法：采用重組Bla g7蛋白激發(fā)樹突狀細胞。使用定量PCR和Westernblotting方法檢測激發(fā)后TIM4的mRNA以及蛋白水平的表達。將磁珠分離后CD4+陽性T細胞與Bla g7激發(fā)活化的樹突狀細胞共培養(yǎng)，采用流式細胞儀檢測CD4+陽性T細胞的分化情況。采用特異性的抑制劑驗證T細胞極化。 結(jié)果：采用重組Bla g7激發(fā)后，樹突狀細胞表面共刺激分子CD80, CD86以及TIM4的表達升高。Bla g7能夠誘導樹突狀細胞分泌IL-13，這一效應是通過TIM4，CD80和CD86依賴的方式。將Bla g7激發(fā)活化后的樹突狀細胞與CD4陽性T細胞共培養(yǎng)后，流式細胞儀檢測T細胞胞內(nèi)IL-4與IFN-γ表達情況，鑒定T細胞Th2向極化情況，同時上清液中的IL-13含量升高�？筎IM4，CD80和CD86抗體能夠分別抑制Bla g7誘導的Th2向分化以及IL-13釋放，提示Blag7誘導Th2向是通過TIM4，CD80和CD86依賴方式。 結(jié)論：蟑螂過敏原Bla g7通過調(diào)節(jié)樹突狀細胞細胞因子釋放，激發(fā)樹突狀細胞誘導T細胞Th2向極化，在過敏性疾病發(fā)生中起了重要的作用 第二部分重組德國小蠊過敏原促進樹突狀細胞TLR4受體表達以及通過MAPK通路促進細胞因子釋放 背景：蟑螂過敏原能夠促發(fā)過敏以及特異性哮喘。Toll樣受體在固有免疫和適應性免疫中起了重要的作用。我們假設(shè)蟑螂過敏原Bla g7能夠扮演TLR4受體激動劑，同時它能夠與TLR4結(jié)合發(fā)揮生物學效應。本項研究主要想解釋Blag7與TLR4在過敏中的相互作用以及背后機制。 方法：采用純化后不同濃度Bla g7激發(fā)樹突狀細胞，使用Western-blotting和流式細胞術(shù)檢測樹突狀細胞表面分子CD80，CD86，HLA-DR和TLR4的表達。采用Western-blotting檢測TLR4的蛋白表達情況。T細胞與Bla g7活化的樹突狀細胞共培養(yǎng)，采用CCK-8法檢測T細胞的增殖情況。采用Western-blotting法檢測TLR下游MAPK信號通路，采用相應抑制劑來反向驗證MAPK通路。 結(jié)果：以不同濃度Bla g7激發(fā)來自于健康人群和過敏人群的樹突狀細胞，，均能夠顯著增加HLA-DR和共刺激分子的表達。Bla g7活化的樹突狀細胞與T細胞共培養(yǎng)后能夠顯著促進T細胞增殖。Bla g7激發(fā)后，樹突狀細胞TLR4的以濃度依賴方式表達升高，抗Bla g7單克隆抗體可以拮抗這一效應。采用免疫共沉淀技術(shù)證明Bla g7能夠結(jié)合細胞膜表面TLR4，進而活化MAPK和NF-κB通路。Bla g7能夠促進細胞因子IL-4，IL-5以及IL-13的釋放，其中來自于過敏人群的樹突狀細胞分泌能力強于正常人群。 結(jié)論：TLR4是樹突狀細胞處理抗原Bla g7的重要媒介，Bla g7通過TLR4方式誘導細胞因子釋放發(fā)揮生物學效應。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：1480312