發(fā)布時間：2018-01-31 23:40

  本文關(guān)鍵詞： 煙曲霉 膠霉毒素 支氣管上皮細胞　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：通過建立煙曲霉感染支氣管上皮細胞的體外模型，以探討膠霉毒素在煙曲霉感染中的作用及其機制。 方法：1、觀察膠霉毒素（gliotoxin GT）對支氣管上皮細胞（human bronchialepithelial cells HBE）凋亡和細胞間粘附分子（ICAM-1）表達的影響：1）藥物配制：膠霉毒素樣品先溶于95%乙醇中，再用培養(yǎng)基（DMEM）稀釋到所需濃度；2）細胞接種：將野生型支氣管上皮細胞以密度為4000/ml接種于直徑9cm培養(yǎng)皿中，每皿5ml，并設(shè)置對照組；3）加藥：分別設(shè)置3個濃度，當(dāng)細胞貼壁48h時（孔底細胞長滿90%以上），加入新鮮含藥培養(yǎng)基5ml，后放入CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。4)結(jié)果的測定：藥物作用24h后，收集不同濃度組細胞及提取各組細胞的總RNA，采用流式細胞儀和RT-PCR檢測細胞凋亡和表達ICAM-1和NF-κB的變化。2、建立煙曲霉感染支氣管上皮細胞的體外模型。1)菌株的培養(yǎng)：將煙曲霉菌接種到PDA瓊脂平板，置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3-4天，連續(xù)活化兩次，PBS重懸孢子并計數(shù)。2)野生型人支氣管上皮細胞（HBE）的培養(yǎng)：將支氣管上皮細胞以密度為4000/ml接種于直徑9cm培養(yǎng)皿中，，每皿加入5ml細胞懸液，后放入CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。3)共培養(yǎng)模型的建立：當(dāng)細胞密度為90%以上時，按1:1000（菌孢子數(shù):支氣管上皮細胞數(shù)）加入菌懸液，37℃、5%CO_2條件下培養(yǎng)2h，PBS沖洗，棄上清液，加入一定量的DMEM完全培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。4)結(jié)果的測定：分別于共培養(yǎng)12、24、36h終止實驗以獲取菌絲、支氣管上皮細胞和12、24、36h提取細胞培養(yǎng)上清液，采用顯微鏡觀察、流式細胞儀（Annexin V-FITC法）和RT-PCR等方法，檢測真菌表達膠霉毒素的水平、支氣管上皮細胞凋亡和ICAM-1的表達情況。 結(jié)果： 1. RT-PCR檢測HBE凋亡基因表達的結(jié)果顯示：膠霉毒素處理后，細胞凋亡基因Bak和Bax均表達上升（p0.005和p0.05），特別Bak基因表達最明顯，且與藥物濃度呈一定相關(guān)性； 2、真菌RT-PCR的結(jié)果顯示：與對照組（煙曲霉孢子狀態(tài)）相比，模型組中12h和24h時間點真菌膠霉毒素的表達沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01），而在36h時間點時真菌膠霉毒素表達明顯升高（P0.01），有統(tǒng)計學(xué)意義。 3、支氣管上皮細胞凋亡基因的RT-PCR結(jié)果顯示：與對照組（支氣管上皮細胞單獨培養(yǎng)時）相比，細胞凋亡基因從24h時間點開始表達上調(diào)，到36h時間點到一個高峰，特別是凋亡基因Bak，表達異常明顯（p0.05）。同時，抑凋亡基因Bcl-2表達下調(diào)，在36h時間點下調(diào)有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（p0.05）。 結(jié)論： 1、膠霉毒素在煙曲霉感染中發(fā)揮著重要的細胞毒性作用。 2、膠霉毒素可能主要通過誘導(dǎo)支氣管上皮細胞凋亡來發(fā)揮細胞毒性作用。 3、膠霉毒素對支氣管上皮細胞免疫反應(yīng)的抑制可能有濃度依賴性。
[Abstract]:Aim: to establish a model of bronchoepithelial cells infected by Aspergillus fumigatus in vitro to investigate the role of collotoxin in the infection of Aspergillus fumigatus and its mechanism. Method 1. To observe the effect of gliotoxin GTZ on human bronchialepithelial cells HBE in bronchial epithelial cells. Effects of apoptosis and ICAM-1 expression on the expression of ICAM-1) the drug preparation: the colloidal toxin sample was first dissolved in 95% ethanol. Then DMEM was diluted to the desired concentration; 2) Cell inoculation: the wild-type bronchial epithelial cells were inoculated in 9cm culture dish with density of 4000ml / ml, 5 ml per dish, and the control group was set up. 3) Additives: three concentrations were set up, when the cells adhered to the cell wall for 48 hours (the cells at the bottom of the pore grew up to 90% or more), and the fresh drug containing medium was added to the culture medium of 5ml. The results of 24 h culture in CO_2 incubator: after 24 hours of treatment, the cells of different concentration groups were collected and the total RNA of each group was extracted. Apoptosis and expression of ICAM-1 and NF- 魏 B were detected by flow cytometry and RT-PCR. 2. In vitro culture of Aspergillus fumigatus infected bronchial epithelial cells: Aspergillus fumigatus was inoculated into PDA Agar plate and cultured in 30 鈩

本文編號：1480306